常用的描述生物活性的参数（FoodChem.通过结构计算提高甜味蛋白热稳定性的潜力）

常用的描述生物活性的参数（FoodChem.通过结构计算提高甜味蛋白热稳定性的潜力）收集的实验数据（主要是monellin突变）以及相应的ΔΔG值在原文中的表1所示，与作者的FoldXΔΔG相比，许多突变只对甜味蛋白产生中度影响，导致热稳定性没有变化。此外，FoldXΔΔG计算在预测突变引起的蛋白质热稳定性变化方面表现良好，特别是对于高度稳定或不稳定的突变。此外，对于稳定/失稳突变，作者还进行了ROC分析，得出的曲线下面积（AUC）值为0.74，远高于随机猜测法。此外，如果将确定的潜在位置考虑在内，成功率将更高，表明FoldX计算在预测更多热稳定突变方面的良好性能。ΔG计算的一个优点是，它可以以低成本获得高通量诱变数据，并立即为甜蛋白工程提供有用的信息。如上所示，目前采用的FoldXΔΔG计算确定了一些可能用于开发更热稳定突变的潜在位置。为了量化FoldXΔΔG计算预测更热稳定突变的能力，作者收集了实验确定的甜味蛋白突变的稳定性和甜度的结果。值得注意的是，甜味蛋白突变的热

大家好，今天推送的文章来自于发表在Food Chemistry上的“ Potential improvement of the thermal stability of sweet-tasting proteins by structural calculations”，作者为中国农业大学食品科学与营养工程学院的唐宁。

近年来，由于糖的过度摄取，糖尿病、肥胖和龋齿的发病率急剧上升，导致食品行业对低热量和营养性糖替代品的需求增加。糖精和阿斯巴甜等人工甜味剂被糖尿病和高脂血症患者广泛用作低热量甜味剂，但据报道，它们有副作用，如导致膀胱癌、心力衰竭和脑瘤。因此，开发新的低热量和无副作用的甜味剂是非常必要的。最近，由于食品工业的上述需求，甜味蛋白受到了广泛关注。迄今为止，发现8种蛋白质（包括brazzein、monellin、thaumatin、curculin、mabinlin、miraculin、pentadin和溶菌酶）具有甜味。这些蛋白质具有高甜度，除了优异的甜度外，这些蛋白质的摄入不会引发对胰岛素的需求。因此，甜味蛋白是非常理想的高强度甜味剂，适合替代人工甜味剂。

甜味蛋白的活性取决于其三维结构，因此在食品加工过程中，它们对极端的物理化学条件非常敏感。虽然最稳定的甜味蛋白brazzein在80℃下加热时可以保持不变性◦为了加工和应用于食品工业，通常需要更高的热稳定性。因此，蛋白质工程成为一种非常有用的工具，使这些甜味蛋白质更适合食品工业应用。目前已经有人进行了一些单氨基酸突变研究，以提高甜味蛋白的热稳定性。Monellin是研究最广泛的甜味蛋白之一，已发现当E23突变为A、L、F、W或Q时具有较高的热稳定性。而当Y65突变为R时，报告了较低的热稳定性提高。这些发现清楚地表明，单氨基酸突变可以帮助作者制备更耐热变性的甜味蛋白。然而，报告的成功案例非常有限，因为这种方法非常耗时和昂贵。

迄今为止，大多数突变研究都是根据随机猜测进行的，这种方法不能有效地找到稳定甜味蛋白的突变，因为自然界在进化过程中已经优化了天然存在的蛋白质。此外，发现一些突变可改善热稳定性，但甜度会降低。众所周知，甜味蛋白通过与甜味受体T1R2-T1R3（位于舌头上的特殊细胞上的异二聚体）结合而产生甜味。该G蛋白偶联受体负责审查所有甜味化合物，包括糖和人工甜味剂。不同的甜味化合物对受体具有不同的结合位点，对于甜味蛋白，其相互作用的特异性仍然很差，这进一步限制了更热稳定的甜味蛋白的发展。

因此，在本研究中，作者使用基于结构的生物物理计算对4种具有可用三维结构的甜味蛋白（brazzein、monellin、curculin和thaumatin）进行了饱和突变，以从大规模突变数据中找到可提高其热稳定性的所需突变。此外，作者建立了T1R2-T1R3的venus fly trap （VFT）结构域的同源性模型，该结构域负责与甜味化合物的相互作用。然后，根据上述模型进行对接研究，以获得甜味蛋白\/T1R2-T1R3复合物的原子细节，这反过来可以提供有益的指导，以保持甜度，同时利用从饱和诱变研究中获得的有前景的突变。与传统的随机猜测策略相比，本研究不仅提供了可能突变的分子机制，可以在保持甜度的同时提高甜味蛋白的热稳定性，而且成本和时间也更低。此外，它也为未来的甜味蛋白工程提供了非常有用的信息。

首先作者进行了饱和突变和热稳定性变化的预测，作为起点，作者使用brazzein、monellin、thaumatin和curculin的已发表结构（1BRZ、1IV7、1RQW和2DPF）进行饱和突变，将所有可能的单点突变引入上述野生型结构。获得的FoldXΔG值下图所示（下图为brazzein的FoldX图，如需看其他三种请阅读原文）。FoldX能量函数提供了蛋白质分子间和分子内相互作用的定量描述，因此可用于预测突变引起的蛋白质热力学折叠稳定性（ΔG）的变化。此外，获得的ΔG值可进一步用于表示热稳定性变化，精度为0.8 kcal/mol ，这已通过对一组蛋白质的基准研究得到证实。因此，ΔG负值表明突变比野生型更热稳定，而ΔG正值表明突变不如野生型热稳定。从这些热图中可以看出，很明显，有一些位置（蓝色垂直柱），如brazzein的D50更容易引入突变，而一些位置（红色垂直柱)，如brazzein的S34更保守，在引入突变时会使蛋白质的热稳定性降低。

此外在热图的水平线上，显然用脯氨酸取代引起的结构限制将导致蛋白质的热稳定性降低。此外，4种甜味蛋白的ΔΔG值分布下图所示，结果清楚地表明，大多数突变仅对所研究甜味蛋白热稳定性产生中度影响，因为大多数获得的ΔG值相对接近0 kcal/mo，这与之前的蛋白突变研究类似。此外，一些突变对热稳定性具有高度破坏性，ΔΔG>10 kcal/mol。与先前的发现一致，只有少数突变似乎稳定了甜味蛋白（4%±2%的突变具有ΔΔG＜−1kcal/mol）。然而，有趣的是，先前的研究表明，一些稳定突变不能保持甜味蛋白的甜味，这些突变需要进一步研究。

ΔG计算的一个优点是，它可以以低成本获得高通量诱变数据，并立即为甜蛋白工程提供有用的信息。如上所示，目前采用的FoldXΔΔG计算确定了一些可能用于开发更热稳定突变的潜在位置。为了量化FoldXΔΔG计算预测更热稳定突变的能力，作者收集了实验确定的甜味蛋白突变的稳定性和甜度的结果。值得注意的是，甜味蛋白突变的热稳定性信息非常有限，因为大多数研究侧重于甜度变化而不是稳定性。此外，对甜味蛋白monellin进行了更深入的研究。

收集的实验数据（主要是monellin突变）以及相应的ΔΔG值在原文中的表1所示，与作者的FoldXΔΔG相比，许多突变只对甜味蛋白产生中度影响，导致热稳定性没有变化。此外，FoldXΔΔG计算在预测突变引起的蛋白质热稳定性变化方面表现良好，特别是对于高度稳定或不稳定的突变。此外，对于稳定/失稳突变，作者还进行了ROC分析，得出的曲线下面积（AUC）值为0.74，远高于随机猜测法。此外，如果将确定的潜在位置考虑在内，成功率将更高，表明FoldX计算在预测更多热稳定突变方面的良好性能。

随后作者分析了甜味蛋白与T1R2-T1R3的VFT结构域之间的相互作用。根据之前的研究，有人认为甜味是由甜味蛋白和T1R2-T1R3的VFT结构域之间的相互作用介导的。此外，提出了一种所谓的楔形模型来解释甜味蛋白与T1R2-T1R3的VFT结构域之间所建议的相互作用的机制。然而，该一般模型是在低分辨率下构建的，基于使用代谢型谷氨酸受体（mGluR1）结构构建的T1R2-T1R3同源模型，并且受到了一些质疑。在本研究中，最近发表的medeka鱼甜味受体结构用于构建VFT结构域的同源性模型，该结构与人类T1R2和T1R3的序列同源性分别为33%和37%。获得的模型如下图所示。

从z分数可以看出，该模型显示出良好的质量，可用于进一步的研究。因此，作者使用ZDOCK基于该模型进行了蛋白质-蛋白质对接，结果如上图所示。对于brazzein，相互作用涉及T1R2和T1R3，而对于其他3种甜味蛋白质，相互作用仅涉及T1R2，表明T1R2对于调节甜味的重要性。此外根据下表中总结的接触和Excel表中总结的相互作用关系，甜味蛋白\/T1R2-T1R3复合物中电荷相互作用占主导地位。这一结果与先前的研究结果一致，即甜度更可能随着正净电荷的增加而增加。

稳定突变更有可能增加蛋白质的甜度，而不稳定突变倾向于降低甜度，从下图中可以清楚地看出这种趋势。

直接使用计算FoldXΔG值预测蛋白质突变的甜度变化。获得的AUC值为0.68，表明预测的热稳定性变化和甜度变化之间相当好的匹配。因此，将不参与或较少参与甜味蛋白和T1R2-T1R3之间相互作用的带负电荷的氨基酸突变为带正电荷的氨基酸是在保持或增加蛋白质甜度的同时发现更多热稳定性突变的有希望的方法。例如，从图1和相互作用（支持信息Excel表）中可以看出，brazzein的D50是一个非常有前途的突变位点，通过FoldX计算也可以预测。

随后鉴于FoldX计算的良好性能，作者更详细地分析了获得的ΔΔG值，试图找到甜味蛋白热稳定突变的一般模式。20种氨基酸分为9类：AVILM标记为疏水性氨基酸，SCTQN标记为极性氨基酸，FWY标记为芳香族氨基酸，DE标记为带负电氨基酸，HKR标记为带正电氨基酸，STY标记为可磷酸化氨基酸，AGST标记为小氨基酸，脯氨酸（P）和甘氨酸（G）。以上9类导致72个突变组，其中包含100多个突变的组被保留用于分析。根据RSA值，将剩余突变组进一步分为暴露组或掩埋组。下图中显示了各组最终计算的FoldXΔ。

当仅考虑预测的稳定突变时，这种趋势更加明显，特别是对于埋藏的残基。这一结果与作者先前的分析一致，该分析表明降低甜味蛋白的负电荷将提高其热稳定性。此外，先前的研究也表明，甜味蛋白的甜度会随着正净电荷的增加而增加。而与芳香族氨基酸、甘氨酸和脯氨酸相关的突变更有可能降低甜味蛋白的稳定性。这可能与结构限制有关，因为上述突变更可能导致蛋白质结构损伤。此外，对于埋藏的残基，与带正电氨基酸相关的突变倾向于降低甜味蛋白的稳定性，而暴露的残基则表现出相反的趋势。对于其他类型的突变，作者没有发现任何系统性趋势。上述表征表明，带电残基是改善甜味蛋白热稳定性的关键残基。

整理：张经纬

文章信息：

doi:10.1016/j.foodchem.2020.128750

文章链接:

https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2020.128750