蛋白表面电势分析原理（实验笔记分子间相互作用分析）

蛋白表面电势分析原理（实验笔记分子间相互作用分析）图1 MST工作原理图微量热泳动是一种表征生物分子特性的光学方法，是粒子在微观温度梯度中的定向运动。生物分子的质量、电荷、水化层和构象发生改变均可导致分子在温度梯度场中运动速度的变化，这种变化可以用来分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。微量热泳动仪是由德国 nano temper 公司发明的设备，2011 年左右投入市场，可测定生物分子的标记荧光和内在荧光信号。MST工作原理见图1。将波长为 1480 nm 的红外激光照射于荧光激发光路上，通过分色镜照射到毛细管中的样品，样品中的水分子吸收红外光发热而形成温度梯度。MST 仪器通过记录激光器打开前、打开期间和打开后处于温度梯度中的样品内部红外激光照射区域的荧光变化情况，从而实现较短时间的测定。

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在生命科学领域中，生物分子间的相互作用具有非常重要的作用。通过分子间相互作用分析不仅可阐明细胞生物学事件，而且为疾病发生机制和药物发现提供基础。MST 技术是一种基于检测在温度梯度中的生物分子电泳迁移率的变化而检测生物分子间结合、解离过程，获取分子间相互作用的模式和动力学常数等方面信息的新技术，是近年来发展的研究生物分子相互作用的强有力工具，已广泛应用于生命科学领域研究。

原理及应用范围

原理

微量热泳动是一种表征生物分子特性的光学方法，是粒子在微观温度梯度中的定向运动。生物分子的质量、电荷、水化层和构象发生改变均可导致分子在温度梯度场中运动速度的变化，这种变化可以用来分析分子间相互作用以及各种化学剂量学参数。微量热泳动仪是由德国 nano temper 公司发明的设备，2011 年左右投入市场，可测定生物分子的标记荧光和内在荧光信号。

MST工作原理见图1。将波长为 1480 nm 的红外激光照射于荧光激发光路上，通过分色镜照射到毛细管中的样品，样品中的水分子吸收红外光发热而形成温度梯度。MST 仪器通过记录激光器打开前、打开期间和打开后处于温度梯度中的样品内部红外激光照射区域的荧光变化情况，从而实现较短时间的测定。

图1 MST工作原理图

应用范围

（1）蛋白-小分子相互作用分析

1.1 蛋白酶与抑制剂相互作用分析

1.2 细胞膜蛋白活性分析

（2）蛋白-肽相互作用分析

（3）蛋白-蛋白相互作用分析

（4）肽-肽相互作用分析

（5）蛋白-核酸相互作用分析

（6）核酸适配子-小分子相互作用分析

技术优势

MST技术将荧光检测的精确性和热泳动的差异性及灵敏性结合起来，提供了一种灵活、稳定和快速检测分子间相互作用的方法，在分析分子相互作用中有独特的优势，不依赖于分子大小、种类的影响，甚至水化层的微小变化也可检测到；可检测溶液中低至pM浓度的分子间相互作用；样品消耗量在μL级；可以在复杂缓冲液中包括血浆和细胞裂解液中进行结合分析；还可以分析结合模式和位点数、蛋白解聚、热力学和酶反应动力学等，是一种强大的详细研究生物分子特征的强有力工具。在生命科学的众多领域已经成功使用MST技术进行了不同生物分子间的相互作用定量分析研究。通过探讨分子间有无结合、结合位点数量、分子间相互作用亲和力等，可为配体、底物、疾病靶点的确定和目标物筛选、浓度分析等提供基础，因此，MST技术在药物筛选、信号转导、分子检测和医学诊断等生命科学领域的应用发展迅速，对推动基础生物医学研究和更好的药物开发有重要作用。

样品制备（举例）

(1) 取已纯化的300 μL TMV 蛋白液，加入 NHS-647 染料，摇匀后放于冰上，在黑暗中孵育30 min；

(2) 将NHS-647染料用column B洗脱，用微量离心管接取标记的蛋白，前三滴加入第一个离心管中，第二管中滴入1 ml 左右的蛋白流出液，第三管、第四管依次接取。-20℃条件保存；

(3) 配制16个梯度浓度的待测化合物溶液，然后分别取10 μL等体积的TMV CP与之混合；

(4) 使用毛细管吸取混合试样，进行MST实验。