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论文重复率低的浏览器（刷高分文章的必备神器）图3 细胞裂解分离。 图片源自于Tim Stuart Rahul Satija. Integrative single-cell analysis. Nature Re裂解分离策略可以平行的进行细胞功能分析，应用此策略可同时检测细胞质中的mRNA和细胞核中的基因组DNA。目前的方法可分为物理法、化学法及生物酶法。单细胞测序的第一步是将目的细胞从样本中分离出，目前主要的技术包括梯度稀释法、显微操作技术、荧光激活细胞分选、 微流控技术和激光捕获显微切割。图2 单细胞分离常用方法 图片源自于Hai-jian Sun Jian Chen Bing Ni et al. Recent advances and curr溶解细胞，获取遗传物质

着高通量测序的发展，在单细胞水平可对肿瘤细胞进行准确的基因检测。单细胞测序技术（SCS）的出现，使得人们可以对肿瘤细胞的基因组学、转录组学以及表观基因组学进行精准的研究。

SCS包括单细胞的分离制备、遗传物质的提取扩增以及遗传物质的高通量测序（图1）。SCS技术广泛应用于肿瘤细胞的异质性研究、突变位点的发现、肿瘤细胞克隆进化的发现及相关新标记物的发现。有助于肿瘤的精准化及个体化治疗。

图1 SCS技术的基本步骤 图片源自于va Hedlund Qiaolin Deng. Single-cell RNA sequencing: Technical ad

单细胞的分离

单细胞测序的第一步是将目的细胞从样本中分离出，目前主要的技术包括梯度稀释法、显微操作技术、荧光激活细胞分选、 微流控技术和激光捕获显微切割。

图2 单细胞分离常用方法 图片源自于Hai-jian Sun Jian Chen Bing Ni et al. Recent advances and curr

溶解细胞，获取遗传物质

裂解分离策略可以平行的进行细胞功能分析，应用此策略可同时检测细胞质中的mRNA和细胞核中的基因组DNA。目前的方法可分为物理法、化学法及生物酶法。

图3 细胞裂解分离。 图片源自于Tim Stuart Rahul Satija. Integrative single-cell analysis. Nature Re

全基因组的扩增

单个细胞中的DNA和RNA含量无法达到测序要求，需要对其进行扩增。

目前分为单细胞全基因组扩增和单细胞转录组扩增。单细胞全基因组扩增(WGA)是通过将单个细胞溶解得到微量基因组 DNA 进行高效地扩增，获得高覆盖度的单细胞基因。最常用的技术为有多重置换扩增技术(MDA)。MDA 技术是在恒温下利用具有强模板结合的 phi29DNA 聚合酶和六聚物进行链置换扩增反应。其优点是样本无需纯化，操作简单，产生的 DNA 片段长，错误率低，有着良好的 DNA 扩增覆盖效果，缺点是起始模板量低时扩增偏差性大。

单细胞转录组扩增，需要通过 PCR 将 m RNA 逆转录成 c DNA。Smart和Smart-seq2 是目前常用的 mRNA 全长扩增技术。SMART用多聚 T 碱基作下游引物开始逆转录，使用逆转录酶SMARTscibeRT 酶，在转录的末端延长出几个超过模板的 C 碱基，转录出c DNA带 3 个 G 碱基的上游引物进行扩增。Smart-seq2技术利用全基因组扩增技术中用到的 Phi29DNA 聚合酶的链置换和连续合成特性，对环化的 cDNA 进行高效扩增。

图5 Smart-seq2技术 图片源自Simone Picelli Omid R Faridani Åsa K Björklund et al. Full-length RN

测序分析

对扩增产物进行测序，对所得数据结果进行分析。下面来看看单细胞测序技术在临床中的应用。

1. 寻找肿瘤相关突变位点

基因突变导致肿瘤，寻找不同阶段的基因突变位点，有助于理解肿瘤的转化机制。2018年发表于Leukemia杂志的文章“Single-cell sequencing reveals the origin and the order of mutation acquisition in T-cell acute lymphoblastic leukemia”中，应用SCS技术，作者在急性T淋巴母细胞白血病中发现了数种新的基因突变位点，并且发现在疾病晚期出现NOTCH1基因的突变，对疾病的严重程度和分期评估具有参考意义。

图6、急性T淋巴母细胞白血病中的突变位点。 图片源自于Jolien De Bie Sofie Demeye Llucia Alberti-Serv

2. 肿瘤细胞克隆进化

肿瘤细胞的克隆进化涉及基因的累积突变，可揭示肿瘤细胞的来源及发展。2020年3月发表于Nature Medcine杂志的文章“Multiplexed single-cell morphometry for hematopathology diagnostics”中，作者应用SCS技术，发现lamin A/C可以促进造血干细胞向T细胞方向分化，且lamin A/C突变常出现于T细胞来源的白血病和淋巴瘤中，这揭示了T细胞白血病和淋巴瘤的发生机理，并为该种疾病的诊断提供了一种新的思路。

图7、不同免疫细胞来源的白血病/淋巴瘤的分子表型。 图片源自于Albert G. Tsai David R. Glass Marisa J

3. 肿瘤免疫治疗

肿瘤免疫治疗为最近几年的热门研究方向，但在同种肿瘤患者中，肿瘤细胞的免疫表型有所差异，对免疫治疗的反应不尽相同，个体差异较大。2020年2月发表于Nature Medcine杂志的综述文章“Single-cell genomic approaches for developing the next generation of immunotherapies”指出，可通过单细胞测序技术，确定不同患者的免疫表型比例，为医师用药提供精准的参考依据。

图8、SCS技术应用于肿瘤的免疫治疗。 图片源自于Ido Yofe Rony Dahan Ido Amit. Single-cell genomic ap

4. 肿瘤的诊断

发表于2014年Nature Methods杂志的综述“Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine”指出人体在生理状态和病理状态下细胞分型不同，单细胞测序技术可以精准定位异常细胞，为疾病的诊断提供依据。

图9、SCS技术应用于疾病诊断。 图片源自于Rickard Sandberg. Entering the era of single-cell transcript

SCS技术在肿瘤的多样性及群体异质性研究方面具有强大优势，为肿瘤研究提供全新的视角。目前，SCS技术在肿瘤研究中还处于初级阶段，相关技术操作较为复杂，成本较贵。简化操作，降低成本，提高检测的灵敏度及特异性是SCS技术今后发展的方向。

参考文献

1. va Hedlund Qiaolin Deng. Single-cell RNA sequencing: Technical advancements and biological applications. Molecular Aspects of Medicine. 2017;2017.1-11. Doi: 10.1016/j.mam.2017.07.003.

2. Hai-jian Sun Jian Chen Bing Ni et al. Recent advances and current issues in single-cell sequencing of tumors. Cancer Letters. 2015; 365(1). 1-10. doi: 10.1016/j.canlet.2015.04.022.

3. Tim Stuart Rahul Satija. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 2019. 20;257-272. Doi: 10.1038/s41576-019-0093-7.

4. Simone Picelli Omid R Faridani Åsa K Björklund et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 2014. 9(1); 171-181. Doi: 10.1038/nprot.2014.006.

5. Jolien De Bie Sofie Demeye Llucia Alberti-Servera et al. Single-cell sequencing reveals the origin and the order of mutation acquisition in T-cell acute lymphoblastic leukemia. 2018.32(6); 1512. Doi: 10.1038/s41375-018-0127-8.

6. Albert G. Tsai David R. Glass Marisa Juntilla et al. Multiplexed single-cell morphometry for hematopathology diagnostics. Nature Medcine. 2020. 26; 408–417. Doi: 10.1038/s41591-020-0783-x.

7. Ido Yofe Rony Dahan Ido Amit. Single-cell genomic approaches for developing the next generation of immunotherapies. Nature Medcine. 2020. 11;1-7. Doi: 10.1038/s41591-019-0736-4

8. Rickard Sandberg. Entering the era of single-cell transcriptomics in biology and medicine. Nature Methods. 2014; 11(1). Doi: 10.1038/nmeth.2764.

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