二次型实验结果分析与讨论（如何保证两次流式实验之间的结果稳定性）

二次型实验结果分析与讨论（如何保证两次流式实验之间的结果稳定性）例：在某panel中APC-CY7第一次实验没使用，而第二次增加了APC-CY7的指标，此时如存在APC/APC-CY7的荧光泄露，则会人为造成APC-CY7这个指标天然的假阳性，一定要在补偿矩阵中进行修正到正常位置这样才会干扰：总的来说，如果你能比较好的注意到如上的几种情况，相信不会因为荧光通道的变更影响到你最终的实验结果；这是首先要考虑的，原则上来说，最好我们是能保证两次流式实验之间的荧光通道的一致性的，这样可以避免因为通道变换导致出现差异的可能性。但是实际情况是我们有时确实是会出现荧光通道的变更，一个是配色增多或减少，例如第一次做的是8色的panel，第二次如果要上升到10色，或者是反过来第二次减少到6色，不论是增多还是减少我们都需要关注变动的荧光素对实验本身的影响，最好做好FMO来进一步判断是否存在补偿变动导致的阳性结果变化；再一个，有的时候我们更换了某个marker的荧光通道，也

最近有一个老师找到我说，之前做的一组多色实验，自己做的时候结果还挺好的，分群啥的都正常，但是一模一样的实验，交给学生去做后，结果出来就稀奇古怪了，自己摸索了半天也找不到原因所在。

其实这个问题很多时候我们都会碰到，毕竟很多时候流式样本很难一次做完，有的临床收样本，可能1-2周才能收集一批病人，或者是涉及到不同时间点的流式检测，也需要把样本分段时间检测，此时如果每次检测的结果存在着批间差异性，结果的稳定性欠佳，那势必会影响到最终的实验结果分析。

所以，如何确保两次流式实验之间的结果足够稳定，具有可对比性呢？

1. 实验的配色方案是否一致，如果不一致，更换的荧光通道是否会影响实验结果：

这是首先要考虑的，原则上来说，最好我们是能保证两次流式实验之间的荧光通道的一致性的，这样可以避免因为通道变换导致出现差异的可能性。

但是实际情况是我们有时确实是会出现荧光通道的变更，一个是配色增多或减少，例如第一次做的是8色的panel，第二次如果要上升到10色，或者是反过来第二次减少到6色，不论是增多还是减少我们都需要关注变动的荧光素对实验本身的影响，最好做好FMO来进一步判断是否存在补偿变动导致的阳性结果变化；

再一个，有的时候我们更换了某个marker的荧光通道，也需要观察更换荧光通道后的补偿变化，每个通道的补偿是根据当前marker来调整的，不能过度的追求稳定而一成不变；

总的来说，如果你能比较好的注意到如上的几种情况，相信不会因为荧光通道的变更影响到你最终的实验结果；

例：在某panel中APC-CY7第一次实验没使用，而第二次增加了APC-CY7的指标，此时如存在APC/APC-CY7的荧光泄露，则会人为造成APC-CY7这个指标天然的假阳性，一定要在补偿矩阵中进行修正到正常位置这样才会干扰：

2. 待测样本本身的状态是否一致：包括样本的浓度，样本的活率，抗体的剂量，以及实验操作的protocol：

首先是样本浓度，没错这一点很多时候都被忽略了，但是我们追溯问题时，往往会发现问题就出现在样本浓度上。

如果你不能做到每次实验都做好样本浓度的统一，就会导致实验结果出现很大的偏差，这是我们目前碰到的导致实验偏差的最大原因，样本浓度过大时，流式仪器的丢弃率，变异率都会显著上升，并且一些抗体的滴定浓度也会达不到，导致阳性率下降的情况发生，所以养成良好的细胞计数习惯是做好流式的必要先决条件之一。

例：过高的样本浓度会变相稀释固定破膜的效率让FOXP3的检出阳性分群不再明显：

其次是样本活率，同样的一个样本，我第一天和第二天上机为何结果就不一样呢？很简单，第二天细胞的状态不再，在体外的细胞往往会随着时间的推移出现死亡，而死亡细胞上的多种蛋白表达都是失常的，并且死细胞上还会因为细胞坍缩引起多种通道的非特异性阳性表达。

所以每次实验的样本活率我们要尽可能保证在一个比较高的水平，如果实在保证不了，也要考虑染个死活来排除一下死细胞的干扰问题。

例：活率较差的细胞会产生更多的碎片，非特异性和变异系数：

再次就是抗体的剂量了，这个其实和样本浓度是挂钩的，也是不太可能出错的，在这里推荐大家每次新买回来一支抗体后都要做一下抗体的浓度滴定实验，找到当前抗体的最佳使用浓度哈。

例：合适的抗体滴定浓度即可保证实验结果的准确：

最后就是实验本身的操作，每次实验的操作一定要养成按照实验记录来进行操作的习惯来，而不要随心随意，导致最终出现了问题不可追溯，这里就不再赘述了。

3. 流式细胞仪本身是否稳定（特别是电压/光电倍增管的稳定性）

这一点是很多老师想不到，但是往往也存在的，虽然流式细胞仪是一台相对高精度的检测仪器，但是仪器终归是仪器，状态也不能说每次都一定是完好无损的。

我们在上机时一定要注意仪器本身稳定性导致的结果偏差，有的仪器在预热不足的时候进行检测，电压波动是很大的，这会让我们的实验结果不具备可比性，而有的仪器因为流动室的拥堵或者是上样浓度的变化也会导致液流变化进而影响到荧光值，所以这也是前面讲的，样本浓度一定不要太高，否则会影响到实验结果。

如何判断一个数据是否存在仪器影响的好坏呢？教大家一个非常简单可行的方法，也是通过flowjo去实现的，打开flowjo把样本拖动进去，双击样本前圆形的标记，flowjo就会自动初步给出样本上机时的状态，并且给出样本的质量报告：

点击这个圆形即可得到报告：

紫红色的时明确得到提示仪器上机IRREGULAR的，而另一个老师自己做的样本是蓝色pass的，最终这个老师的问题也很可能出在第二次上机的仪器不规则收样上，当然这个不规则收样也很可能和样本本身的状态有关系了。

其实flowjo还支持我们对不好的样本进行拯救，就是flowjo插件中的FLOWAI功能，可以把不稳定的细胞进行剔除从而得到更加稳定的实验数据，这个感兴趣的老师也可以去摸索一下：

就是这个界面了。

时间短暂，本周的罗工秘笈也就到这里告一段落了，希望能对各位flower有所帮助！