单因素随机区组方差分析公式（如何制备流式样本）

单因素随机区组方差分析公式（如何制备流式样本）脾脏单细胞的采集：当样本采集进采血管后我们可以就地放于常温或者4度避光保存，有文献报道说采血管中的样本在24h内置于常温保存的效果会更好于4度，这点大家也可以参考，但是对于需要长途运输超过24h的样本还是推荐大家对样本进行一定的降温，这样有助于长时间的样本稳定性。血液/骨髓的采集：血液和骨髓的样本都是比较理想的液体样本，我们的采集一般都会使用到采血管，能够满足后续流式实验的采血管一般来说有2种最为常见，即肝素钠抗凝的绿头采血管，以及edta抗凝的紫头采血管。大部分的流式实验2种采血管都是可以任意选择的。但是在一些特殊实验中，我们是不能使用edta抗凝的紫色采血管的，比如细胞凋亡实验，以及需要对细胞进行刺激的分泌型细胞因子（例如IFN IL-4等）的检测实验，这些实验都需要细胞表面有比较大的钙离子丰度，如果使用edta抗凝管会洗脱掉钙离子从而让实验结果变得不可控。

很多时候碰到做流式的老师都在问一个问题，到底为啥我的实验结果不好看？大部分情况下去追本溯源，最后都会发现是一开始样本制备上或多或少出现了一些问题。流式的样本制备在我们一些老flower的眼里是一个“一力降十会”的过程，如果你的样本制备好了，后续上机再怎么粗糙，实验结果也不会差到哪里去，而如果我们的样本制备的不好，往往后续再怎么调整分析，也很难得到理想的实验结果。

本期开始我会跟大家仔细聊聊流式样本制备的一些流程和注意要点，试图帮助大家少走弯路，更好的获得高质量的流式样本。

首先我们先讲血液/骨髓/脾脏的制备，血液/骨髓/脾脏的样本特点是：成分相对简单，大部分都是免疫细胞。细胞间质少，组织细胞少，所以制备起来相对也比较简单，原则上我们将上述样本中的红细胞去除掉以后，大部分剩余细胞都是单纯的免疫细胞亚群了。

一、样本的采集：

血液/骨髓的采集：

血液和骨髓的样本都是比较理想的液体样本，我们的采集一般都会使用到采血管，能够满足后续流式实验的采血管一般来说有2种最为常见，即肝素钠抗凝的绿头采血管，以及edta抗凝的紫头采血管。

大部分的流式实验2种采血管都是可以任意选择的。但是在一些特殊实验中，我们是不能使用edta抗凝的紫色采血管的，比如细胞凋亡实验，以及需要对细胞进行刺激的分泌型细胞因子（例如IFN IL-4等）的检测实验，这些实验都需要细胞表面有比较大的钙离子丰度，如果使用edta抗凝管会洗脱掉钙离子从而让实验结果变得不可控。

当样本采集进采血管后我们可以就地放于常温或者4度避光保存，有文献报道说采血管中的样本在24h内置于常温保存的效果会更好于4度，这点大家也可以参考，但是对于需要长途运输超过24h的样本还是推荐大家对样本进行一定的降温，这样有助于长时间的样本稳定性。

脾脏单细胞的采集：

脾脏也是我们常见的流式研究对象样本之一，脾脏本身是生物体最大的储血器官，其内部大部分成分其实也是血液，我们在摘取脾脏后只需要对脾脏进行碾磨就可以轻易的获取脾脏中的血细胞了，当然需要大家注意的是碾磨本身需要柔和，以及碾磨后要及时的过滤以获得比较好的单细胞悬液。

这里给大家一个我常做的脾脏处理的步骤作为参考：

1. 将脾脏组织转移到35mm无菌培养皿中。后续如需进行细胞分选，在培养皿中加入5mL1640基础培养基。如解离组织后不需细胞分选，请在培养皿中加入含1mMEDTA的PBS。

2. 去除脾脏组织上的结缔组织或脂肪，注意坏死区域，并检查脾脏是否有肿大、变色或病变。记录起始样本的状态对于后期评估细胞非常重要。

3. 从5ml无菌注射器中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏，碾磨至无明显红色结团为止，这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞。

4. 将一个70μm细胞过滤器置于15或50mL无菌锥形管上，并用2ml推荐培养基润洗滤网。注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况。

5. 使用润洗过的5或10mL移液管或移液枪将脾细胞吹打均匀。

6. 将培养皿中的物质全部转移至润洗过的70μm细胞过滤器中。使用注射器的活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式在滤网里继续轻柔碾磨，从而使细胞和组织通过滤网。用3mL推荐培养基冲洗滤网，继续碾磨通过。

7. 将收集到离心管里的脾脏细胞平衡后放置于离心机离心，转速为250g-300g，离心时间6min。

8. 取出离心管，倒去上清，轻轻敲击试管重悬细胞。

二、样本的单细胞制备：

当我们将血液/骨髓/脾脏等样本采集完毕后，我们需要做的就是对其中待测单细胞进行提取，针对这些样本最常使用的提取方法有两种，分别是利用细胞的密度不一致进行梯度密度离心的ficoll法，以及利用这类样本成分比较单一的红细胞去除的裂红法。

裂红法：

又叫红细胞裂解或者溶血，使用的试剂是红细胞裂解液，此种方法的优点在于操作简单，得率高，能够短时间内高效获得全免疫细胞亚群，个人非常推荐。但是需要注意的是如果后续的样本不是用于流式分析而是需要培养或者冻存复苏，裂红后再培养的细胞活性可能就会打折扣了。

ficoll法：

即梯度密度离心法，可以利用细胞的密度不一致的原则比较有效的分离出淋巴 单核细胞的混合物，即PBMC，这种分离方法的优点在于对细胞的活率影响很小，有利于细胞后续的培养，而缺点则在于实验步骤复杂，而且细胞的得率也比较低，并且这种方法往往会损伤掉大部分的粒细胞和一部分单核细胞，不利于我们整体的亚群分析。

所以总结一下，如果单纯是为了检测而不是培养，我个人是很中意裂红法的，方便又好用。

三、样本本身的质量控制：

细胞数量：

细胞数量，流式检测的细胞数量至少要满足10E5，如果我们制备的样本细胞低于这个数量就无法开展下游得率流式检测实验，那对于实验者来说这个样本制备就毫无意义。但是，对于血液/骨髓/脾脏这类样本，我们面临的问题并不是细胞数太少，而是细胞数有时太多。因为这类样本太好获得了，比如脾脏的样本，一个脾脏内往往至少就有10e8的细胞数，如果我们不对细胞进行计数而直接取了单细胞悬液就去染色，会导致我们的抗体染色效率直线下降。所以针对这类样本，细胞计数是一定要去进行的一项工作，个人推荐每个样本的细胞数在10e6左右为佳。

细胞活性：

需要注意的是死细胞/处理中的破损细胞会对实验结果产生各种不利的影响，所以我们需要保证在样本处理过程中的细胞活性，如果无法保证，则需要加入死活细胞染料来进行死细胞的排除。

细胞的抗体染色特异性：

要知道抗体的结合除了特异结合外，往往还存在着和细胞表面的fcr的非特异性结合，所以我们最好能够在染色前孵育一遍FC受体阻断剂，以提高染色结果的准确性。

当我们注重了样本采集，单细胞制备和样本质控后，我们的实验结果会变得更好，更有利我们得到理想的流式结果。当然，除了我们常见的血液/脾脏/骨髓样本外，很多老师也在深入研究组织中的免疫微环境，这就不免会涉及到肿瘤，组织中的免疫细胞的获取，下期罗工秘笈我会深入的和大家交流如何有效的获取组织中的免疫细胞，希望对大家有所帮助：）

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