t细胞抵抗病毒（T细胞病毒转染）

长生 2023-03-28 13:36:35 326

t细胞抵抗病毒（T细胞病毒转染）细胞转染CD4 T 细胞体外刺激※若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于 18～20℃ 保存。※在较高的离心速度下（400～500 g）可以提高 PBMC 的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60～100 g）可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。细胞体外刺激

t细胞抵抗病毒（T细胞病毒转染）(1)

细胞制备

[ 小鼠脾脏细胞悬液制备 ]

脱颈处死小鼠，腹部朝上，正体位暴露小鼠右侧腹部，75％乙醇消毒，剪开腹部切取脾脏。
将脾脏放入预先放置好 cell strainer（FALCON，352350）并已加入 5 ml 无菌 PBS 的六孔板或培养皿中，用无菌注射器柄充分研磨脾脏。
弃掉 cell strainer，轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到一无菌 15 ml 离心管中，于 4℃ 400 g，离心 5 min。（一旦取出脾脏，请置于冰上操作）。
将离心后弃上清的脾脏细胞用 5 ml 无菌ACK裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解 5 min。

※ACK 裂解液配方如下表，配好之后用 0.22 μm 的滤膜过滤，4℃ 保存不超过 1 月。

t细胞抵抗病毒（T细胞病毒转染）(2)

裂解结束后加入 10 ml 无菌 PBS 终止裂解反应，4℃ 400 g 离心 5 min。
弃上清，用 10 ml 无菌 PBS 洗一次，弃上清，加入培养基重悬计数，一只脾脏可得 30000000 个细胞（完成后，将细胞重悬在合适体积的 PBS 中）。

[人 PBMC 细胞制备]

取 15 ml 离心管，加入 2 ml 已用抗凝剂处理过的人血液样品，再加入等体积的 PBS 进行稀释（终体积 4 ml），上下颠倒或用枪混匀样品备用。

※若为经过处理的浓缩血液样品，请按照新的稀释倍数合理稀释。为了保证分离细胞的活力和效率，请使用新鲜血液，血液样品请于 18～20℃ 保存。

上下翻转确保 Ficoll-Paque PLUS (GE) 分离液彻底混匀，去掉聚丙烯瓶盖，使用注射器针头插入瓶塞吸取 3 ml 分离液。（分离之前请将 Ficoll-Paque PLUS 分离液预热至 18～20℃）。

取一新的无菌 15 ml 离心管，加入 3 ml 分离液。小心加入稀释好的 4 ml 血液样品，不要打破 Ficoll-Paque PLUS 液面。（可将离心管倾斜至与水平台面呈 30°，缓慢沿管壁加入血液样品）。

将离心管小心竖直放入离心机内，于 18～20℃，400 g 离心 30～40 min（将离心机的降速加速度调到 0）。
小心取出离心管。此时液体分为 3 层，中层为分离液层，最下层为红细胞，最上层为血浆。位于中层靠近血浆层的白膜层即为单个核细胞层，小心吸走血浆层，不要打动白膜层。（可吸出最上层的血浆层保存以备后续使用），用无菌移液枪将白膜吸到一新的离心管中。

用三倍体积（约 6 ml）的无菌 PBS 重悬PBMC，重悬时用枪轻柔吹散，于 18～20℃，400 g 离心 10～15 min，重复一次，最后用培养基重悬备用，多余的 PBMC 可以冻存继续使用。

※在较高的离心速度下（400～500 g）可以提高 PBMC 的得率，同时需注意在较低的离心速度下（60～100 g）可以分离掉不需要的血小板。另外如上操作和比例适用于更大体积的分离。

细胞体外刺激

CD4 T 细胞体外刺激

按照小鼠或人源 CD4 T 细胞分离 kit (Thermo) 说明书分离得到 CD4 T 细胞。
取所需体积的 PBS，按照 5 μg/ml 的终浓度加入 Anti-mouse CD3e 和 Anti-mouse CD28 抗体，500 μl/孔包被 Non-Treated 24-well plate，室温放置 4 h，吸掉抗体悬液，加入 500 μl 1% BSA（PBS 配置）室温封闭 30 min，加入 500 μl PBS 洗孔一次。（分离细胞的同时准备好平板和后续感染所需的量）。
将分离得到的 CD4 T 按照浓度 5x105 cell/ml 重悬在完全 T 细胞培养基中（1640，10% FBS，1% penicillin-streptomycin，50 μM β-mercaptoethanol 100 U/ml IL-2），将细胞加入包被处理好的平板，2 ml 每孔，然后放入 37℃ 二氧化碳培养箱刺激培养 48 h。细胞在刺激 24 h 后体积略微增大，进入活化状态，刺激 48 h 后可进行病毒感染。

细胞转染

收集活化好的 CD4 T 细胞，400 g 离心 5 min。用 T细胞培养基重悬计数备用，在收集的过程中发现有些细胞会贴壁，此为正常现象，可反复吹打至贴壁的细胞也呈悬浮状态。
另取一 Anti-mouse CD3e 和 Anti-mouse CD28 抗体包被好的 24 孔板，每孔加入 200000-500000 的细胞（若为 96 孔板，加入 20000个细胞/孔）。若考虑长期表达目的基因，按 MOI=50-100 加入汉恒生物T 细胞专用逆转录病毒 mTRv-GFP 或者 hTRv-GFP，注意鼠源和人源原代T细胞所适合的逆转录病毒种类差别；若考虑瞬时（一周以内）表达目的基因，可按 MOI=500-1000 加入汉恒悬浮细胞专用腺病毒 Ads-GFP。同时加入 polybrene 至终浓度 6 g/ml，最终感染体积为 500 μl，加入病毒后轻轻吹打混匀。

※具体 MOI 选择可在 96 孔板中预实验进行梯度摸索，对于逆转录病毒建议使用 10，30，100 的梯度进行，对于腺病毒建议使用 500，1000，1500 的梯度进行摸索。

24-well plate 于 1000 g 室温离心感染 90 min。离心结束后将平板放入 37℃ CO2 培养箱感染 6 h。
感染结束后取出培养板，小心吸掉感染孔中 350 μl 的培养基（70%），加入 1.85 ml 的T细胞完全培养基补足体积为 2 ml 并吹打混匀。

※离心结束观察细胞分散状态，除非细胞全聚集在一处，否则不建议吹散细胞。

将细胞放入 37℃ 二氧化碳培养箱继续培养，2～3 天后可观察荧光，做流式检测感染效率。正常情况下，汉恒生物提供的T细胞专用逆转录病毒（mTRv 和 hTRv）和悬浮细胞专用腺病毒（Ads）感染原代T细胞的效率大于 50%。
感染后刺激的细胞增殖较快，请注意观察细胞密度并使其维持在 1000000/ml 左右。此外，如果需要让细胞增殖较长时间，为了防止其过度活化，可撤掉抗体的刺激。

【病毒传染结果图】

t细胞抵抗病毒（T细胞病毒转染）(3)