高中生物必修二dna复制的特点：高中生物选修1教材答案-13
高中生物必修二dna复制的特点：高中生物选修1教材答案-13大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。（二）PCR的反应过程：知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段
本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。
课题重点与难点课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。课题难点：PCR的原理。
课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。
基础知识分析（一）PCR原理：知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；
2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。
（二）PCR的反应过程：知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。
实验案例PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段
1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。
大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g
葡萄糖10 g 微量盐溶液40 mL 半胱氨酸盐酸盐0.5 g
0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.0。
其中，微量盐溶液的配方如下。
CaCl2 0.2 g MgSO4·7H2O 0.48 g K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g
培养双歧杆菌24 h后，将菌液进行离心，双歧杆菌将沉淀在试管底部。
2．PCR操作。往双歧杆菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方为50 mmol/ L 的Tris-HCl 0.5 %的Tween 20 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH为8.0），使细胞裂解，释放出DNA。将裂解液在55 ℃温度下加热孵育3 h后，再在95 ℃温度下加热10 min，然后立即放入冰水中冷却。冷却后离心，将10 μL上清液转移到0.5 mL的离心管中，然后依次加入10倍浓缩的扩增缓冲液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸馏水29 μL，两种引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL。混匀后按教科书表格中的数据设定PCR程序，进行反应。
需要说明的是，进行本实验可以直接购买试剂盒，试剂盒的价格比单独购买试剂的价格要低，并且包括了PCR所需的所有试剂。但是，试剂盒上往往只标出了试剂号，而没有标明试剂的名称，因此购买时要进行详细的咨询。如果单独购买试剂，PCR所需的引物必须委托相关的试剂公司来合成，合成后必须低温保存，否则引物容易发生降解。本实验所用引物的碱基序列如下。
引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′
引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表碱基次黄嘌呤 它可以与A、G、C、T中的任何1个碱基配对)。
3．PCR产物的检测。产物的检测除了可以采用教科书中提供的方法外，还可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法。琼脂糖凝胶电泳的有关介绍可参见本专题中课题3《血红蛋白的提取和分离》以及本课题的参考资料，具体操作步骤如下。
（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。
（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入电泳槽中，待其凝固。
（3）配制0.5倍的TBE电泳缓冲液100 mL。配制方法见本课题的参考资料部分。
（4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内有气泡，应设法除去。
（5）在DNA样品中加入相当于样品0.2倍体积的载样缓冲液（载样缓冲液的成分参见本课题中参考资料），混匀后，加入样品孔内。
（6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。DNA样品是由负极向正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为1～50 V/cm(长度以两个电极之间的距离计算)。
（7）当指示剂移动到凝胶边缘时，断开电源，终止电泳。一般200～400个核苷酸长度的PCR产物，在50 V电压下，电泳20～40 min即可。
（8）将凝胶放入溴化乙锭溶液中染色后，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。
课题成果评价DNA片段的扩增是否成功
检测DNA片段的扩增情况，既可以采用教科书中提供的方法，也可以采用教师用书中实验案例提供的方法。对于教科书中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果；对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
答案和提示练习
1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1 073 741 824)。
2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。
