crispr-cas9技术简述（学做CRISPR-Cas9从sgRNA开始安捷伦给你解决方案）

crispr-cas9技术简述（学做CRISPR-Cas9从sgRNA开始安捷伦给你解决方案）体外合成gRNA试剂盒：安捷伦还提供SureGuide gRNA 合成试剂盒（货号5190-7719），可在 2 小时内合成和纯化 gRNA，节省实验时间。合成系统是经过广泛优化和验证的，我们拿到可以直接使用，无需再考虑试剂问题。这一款适合来源于各种 DNA 模板设计的 gRNA 转录，灵活性较高。试剂盒中还包含对照模板 DNA，可以用来确认反应是否成功。第二步：sgRNA合成定制化学合成sgRNA：安捷伦拥有SurePrint专利技术，可以合成高质量的sgRNA，还有独特的修饰技术，来增强sgRNA的稳定性，定制序列可长达 140 nt，根据要求可提供更长的序列。数量从 100 µg 到 100 mg (3–3000 nmol)，可适应您不同的实验规模，采用研究和开发级 GMP 材料。且化学修饰是不需要额外收费的。第一步：sgRNA 设计安捷伦在线Suredesign 平台，你只需要注册

这次鲁大师二话不说，直接上干货！ 先来一个CRISPR-cas9介绍！

CRISPR-Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。. 而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是从微生物中得到启发对靶向基因进行特定DNA编辑的技术。
根据用途可以分成三类：
1 基因敲除（CRISPR knockout）
2 基因激活 （CRISPR activation）
3 基因干扰（CRISPR interference）

在自然中CRISPR系统分为三部分：
第一部分是Cas9蛋白，它是一种核酸酶，可以切割基因。
第二部分是crRNA（CRISPR RNA），作用就像个导游，可以定位到目标基因，和靶位点序列配对。
第三部分是tracrRNA（Trans-activating crRNA），有发夹结构。
三者结合形成复合物，可谓是手拉手，齐干活，实现基因编辑。

随着CRISPR-Cas9技术的发展，我们可以在体外把crRNA和tracrRNA进行人为构建，这样我们就等于有了更加便捷的工具。体外合成的crRNA和tracrRNA 结合体就是sgRNA。
大家的科研老朋友安捷伦围绕sgRNA 提供一系列贴心服务， 妈耶一下子就实现了实验自由有没有！搞好sgRNA，CRISPR-Cas9再也不迷路，想切哪里切哪里啊

第一步：sgRNA 设计
安捷伦在线Suredesign 平台，你只需要注册一个自己的账户就可以去定制安捷伦旗下左右的服务，当然也包括我们的sgRNA设计。
只需要注册一个账户，然后点击Sureguide图标，按照步骤进行设计，最后就可以得到我们目的基因的sgRNA序列。

图 1 安捷伦suredesign 平台设计sgRNA

在设计的过程中，我们可以选择各种参数，例如Protospacer adjacent motif（PAM），最常用的就是NGG.

第二步：sgRNA合成
定制化学合成sgRNA：安捷伦拥有SurePrint专利技术，可以合成高质量的sgRNA，还有独特的修饰技术，来增强sgRNA的稳定性，定制序列可长达 140 nt，根据要求可提供更长的序列。数量从 100 µg 到 100 mg (3–3000 nmol)，可适应您不同的实验规模，采用研究和开发级 GMP 材料。且化学修饰是不需要额外收费的。

体外合成gRNA试剂盒：安捷伦还提供SureGuide gRNA 合成试剂盒（货号5190-7719），可在 2 小时内合成和纯化 gRNA，节省实验时间。合成系统是经过广泛优化和验证的，我们拿到可以直接使用，无需再考虑试剂问题。这一款适合来源于各种 DNA 模板设计的 gRNA 转录，灵活性较高。试剂盒中还包含对照模板 DNA，可以用来确认反应是否成功。

第三步：sgRNA质控
生成的sgRNA 必须先过质量控制这一关，才能继续下面的实验。如果咱们的sgRNA 本身已经被降解了，或者不纯，那会严重影响我们后续的实验。安捷伦有一系列的自动化电泳质控仪器，今天鲁大师以安捷伦2100生物分析仪为例，来给大家介绍。我们可以使用安捷伦小RNA试剂盒在安捷伦2100生物分析仪上进行分析。将纯化后gRNA样品稀释到检测定量范围，在80°C下变性2分钟（以减少二级结构）， 按照说明书进行分析。在生物分析仪中我们可以直接得到RNA质量分析结果

图 2 使用安捷伦2100生物分析仪进行sgRNA检测结果，以Zinc Finger Protein Homology 42 (ZFP42) 和 Glucuronidase Beta (GUSB)这两个基因为例。

除了检测sgRNA是否完整之外，还可以通过2100生物分析仪检测sgRNA的片段大小以及sgRNA的样本定量。这样我们就可以获得sgRNA全面的质控信息，来决定下一步实验是否继续。

图 3 A)安捷伦2100生物分析仪小RNA试剂盒在分析gRNA样本的片段大小。B)使用2100生物分析仪小RNA试剂盒进行gRNA样本定量。

第四步：合成sgRNA 效率验证

SureGuide Cas9核酸酶试剂盒（货号5190-7715）是用于体外 CRISPR-Cas9 研究的一体化解决方案的重要组成部分。利用该试剂盒可实现较大基因或DNA 片段的体外克隆，并且消除了常见限制性内切酶或 PCR 保真度的限制，一看就是非常的给力。除此之外，安捷伦还提供一款更加便利的SureGuide CRISPR/Cas Complete Kit （货号 5190-7714），这一款包含了体外sgRNA合成和Cas9核酸酶等所有的配套试剂，咱们只需要设计好sgRNA就可以愉快的做实验啦。

接着安捷伦2100生物分析仪再次出马，用来验证目的基因酶切效率，检验是否敲除成功。这一次咱们可以选取High sensitive DNA 试剂盒（货号5067-4626）来进行验证。通过2100生物分析仪我们可以得到胶图。通过图片可知M3-GUSB样本实验失败 M2-GUSB比E2-GUSB样本酶切效率会低，因为M2-GUSB留下了更多未被酶切的模板。

图 4 安捷伦2100生物分析仪检验GUSB基因Cas9酶切效果。阳性对照表示最理想的酶切片段大小。阴性对照表示酶切失败。