酶分子化学修饰及其机理（FoodChemistry高压处理多酚氧化酶的结构研究及分子动力学模拟）

酶分子化学修饰及其机理（FoodChemistry高压处理多酚氧化酶的结构研究及分子动力学模拟）疏水性、致密性和氢键分析用均方根偏差(RMSD)分析了蛋白质模拟系统的结构稳定性和运动变化。RMSD值显示，高压模拟过程中，PPO的所有结构逐渐稳定在2.5~2.7 nm之间，在所有条件下，模拟结构在40 ns后都有一个稳定的轨迹。均方根波动(RMSF)可以反映蛋白质中氨基酸残基相对于相应平均位置的波动程度。氨基酸残基在0.1 MPa和200 MPa下的柔性低于在400 MPa和600 MPa下的柔性，表明结构在0.1 MPa和200 MPa下更稳定。在400 MPa和600 MPa下，70–90和240–260个残基的RMSF值显著增加，表明高压导致活性中心上氨基酸的显著波动，从而导致活性的变化。Fig. 1a显示了HPP处理后PPO活性的变化。200 MPa HPP作用10~50 min后，酶活性被激活。HPP处理10 min后，酶活达到最高，为116.4%。当压力达到400 MPa和

今天推送的文章发表在Food Chemistry上的“Structural studies and molecular dynamic simulations of polyphenol oxidase treated by high pressure processing”，通讯作者为昆明理工大学食品科学与工程学院的周林燕老师。

多酚氧化酶(PPO，EC1.14.18.1)是一种含铜的氧化还原金属酶，其活性中心有两个铜原子。PPO的活性中心位于四个螺旋束形成的疏水口袋的中心，每个铜离子与三个His残基中的N原子形成配位键，形成特殊的三角金字塔形状。高压处理(HPP)可以灭活微生物和酶，对食品的营养和感官特性影响最小，是一种很有前途的热加工替代方法。但HPP对PPO活性的失活效果差异较大。HPP能激活PPO活性，这可能是由于一定压力处理使PPO部分解离和活性位点暴露增加所致。而HPP也能抑制PPO的活性，这可能主要是因为HPP破坏了PPO的弱结构，导致了PPO的构象变化。HPP一般不影响蛋白质的一级结构，但二级、三级和四级结构可能受到不同程度的破坏。

目前已经有一些关于HPP影响PPO活性的机制的研究，但大多数都没有从分子水平上阐明活性与结构之间的关系。分子动力学模拟(MD)可以探索蛋白质在各种条件下构象和功能的动态变化，直接从分子水平提供蛋白质的微观结构信息，包括体积、肽链、二级结构、三级结构、键的断裂/形成和折叠/去折叠。此外，MD模拟可以在分子水平上直观地显示高压下蛋白质活性中心周围的结构变化，并有可能揭示HPP失活酶的机理。作者通过MD模拟研究了PPO在高压下构象的动态变化，获得了PPO分子在体积、氢键、疏水性、二级结构、铜结合区和环的运动等方面的信息。通过圆二色谱(CD)、荧光光谱、傅立叶变换红外光谱(FTIR)和拉曼光谱等光谱实验，观察了HPP处理后PPO的二级结构和三级结构的变化。同时，对PPO的构象变化与活性之间的关系进行了关联，从分子水平上探讨了PPO的活化和失活机制。

HPP对PPO活性的影响

Fig. 1a显示了HPP处理后PPO活性的变化。200 MPa HPP作用10~50 min后，酶活性被激活。HPP处理10 min后，酶活达到最高，为116.4%。当压力达到400 MPa和600 MPa时，HPP对PPO表现出失活作用，且随着处理时间的延长，PPO的残余活性降低。在600 MPa HPP处理50 min后，其残余活性最低，仅为20%。

高压诱导PPO构象变化的分子水平分析

RMSD和RMSF分析

用均方根偏差(RMSD)分析了蛋白质模拟系统的结构稳定性和运动变化。RMSD值显示，高压模拟过程中，PPO的所有结构逐渐稳定在2.5~2.7 nm之间，在所有条件下，模拟结构在40 ns后都有一个稳定的轨迹。均方根波动(RMSF)可以反映蛋白质中氨基酸残基相对于相应平均位置的波动程度。氨基酸残基在0.1 MPa和200 MPa下的柔性低于在400 MPa和600 MPa下的柔性，表明结构在0.1 MPa和200 MPa下更稳定。在400 MPa和600 MPa下，70–90和240–260个残基的RMSF值显著增加，表明高压导致活性中心上氨基酸的显著波动，从而导致活性的变化。

疏水性、致密性和氢键分析

如Table 1所示，随着压力从0.1 MPa增加到600 MPa，PPO的体积从593.346 nm³减少到500.293 nm³。回转半径（R_g）代表蛋白质结构的整体致密性。当压力从0.1 MPa增加到600 MPa时，Rg值从2.078 nm逐渐增加到2.143 nm。荧光猝灭用于评估蛋白质构象的密度。K_SV代表KI的Stern-Volmer常数，f代表色氨酸基团的淬灭程度。由于构象的微小变化，PPO的K_SV和f值在200 MPa以下略有波动。随着压力的增加，600 MPa HPP持续50 min后，K_SV值显著增加至5.589。f值有不同程度的变化，除在600 MPa高压处理50 min后f值显著下降至0.263外，其余值均有升高或波动，表明蛋白质的有序结构丢失，结构变化变得更松散。

溶剂可及表面积（SASA）是描述疏水性的重要参数，由VMD计算的疏水性和亲水性SASA值如Table 1所示。随着压力的增加，疏水性SASA值从5677 nm²逐渐降低到5283 nm²，而亲水性SASA值从13370 nm²逐渐增加到13708 nm²。外源荧光光谱常用于研究蛋白质表面疏水簇的暴露(Fig. 1b)。随着压力的增加，荧光强度逐渐降低。特别是在600 MPa的高压下处理50 min后，PPO的荧光强度下降了近一半，λ_Max也出现了轻微的红移。这一现象表明，HPP诱导了PPO分子的去折叠和氨基酸残基暴露在极性溶剂中。

随着模拟压力从0.1 MPa增加到600 MPa，分子内氢键数目从302个逐渐减少到276个，表明高压可以破坏蛋白质的氢键。高压后PPO分子内氢键数目减少，破坏了PPO的二级和三级结构，影响了PPO的稳定性。如Fig. 1e所示，FTIR光谱显示PPO的主要谱带是酰胺A和酰胺I，它们分别是肽链N-H伸缩振动(约3420 cm⁻¹)和C=O伸缩振动(约1657 cm⁻¹)的结果。酰胺A中N-H官能团的伸缩振动表明存在分子间氢键。0.1 MPa下PPO的酰胺A峰在3402 cm⁻¹处，HPP处理后向更高的波数方向移动。特别是在600 MPa下HPP处理50 min后，酰胺A峰移动到3420 cm⁻¹，表明N-H键的氢键被破坏。0.1 MPa下PPA的酰胺I峰在1657.75 cm⁻¹处，而在600 MPa下处理50 min后，酰胺I峰移至1655.38 cm⁻¹处。PPO在1100 cm⁻¹以下的部分峰比较稳定，表明二硫键在高压下仍能保持完整性。利用拉曼光谱分析了HPP处理后PPO的结构变化。如Fig. 1f所示，拉曼光谱中PPO的主要谱带分别集中在760 cm⁻¹、1080 cm⁻¹和1800 cm⁻¹附近。此外，在波数为1500~2000 cm⁻¹范围内形成一个宽峰，在1655 cm⁻¹附近有酰胺I峰。在600 MPa HPP处理50 min后，PPO的谱带强度从1005.6 cm⁻¹降至590.9 cm⁻¹，说明高压对PPO的氢键有明显的破坏作用。

PPO的二级结构分析

如Fig. 2a所示，与0.1 MPa下模拟的PPO二级结构相比，200 MPa、400 MPa和600 MPa下模拟的PPO二级结构都有不同程度的变化。总体上，α-螺旋含量保持稳定，而β-折叠和3-10个螺旋含量略有增加，在200 MPa、400 MPa和600 MPa的高压模拟下发生了无规卷曲构型的破坏。在所有的模拟压力水平下，PPO活性中心的α-螺旋组成都保持稳定。

CD测量支持了模拟得到的二级结构的变化。未处理的PPO的α-螺旋的两个负峰在208 nm和222 nm附近，β-折叠的正峰在216 nm附近(Fig. 1c)。当HPP从0.1 MPa增加到400 MPa时，α-helix、β-Sheet、β-Turn和无规卷曲的含量稳定，分别保持在26%、23%、18%和30%左右(Table. 1)。当压力增加到600 MPa时，β-Sheet和无规卷曲的含量分别为24%和28%。

活性中心附近重要残基的运动分析

Trp残基对微环境的微小变化非常敏感，常被用来反映蛋白质的三级结构。如Fig. 2b所示，在所有模拟压力下，Trp293与Tyr97之间的距离略有波动，并稳定在3.5 Å左右，而Trp93与Phe90、Tyr97之间的距离在压力模拟后发生了显著变化。当压力从0.1 MPa增加到400 MPa时，Trp93与Lyr97之间的距离不随压力变化，而Phe90与Trp93之间的距离从3.9 Å增加到5.2 Å，在一定程度上减弱了Trp93的荧光强度。600 MPa压力模拟后，观察到Trp93与Lyr97之间的距离从2.9 Å增加到3.9 Å，而Phe90与Trp93之间的距离没有变化。

作者采用内源荧光法研究了HPP处理后PPO色氨酸残基周围的微环境(Fig. 1d)。天然PPO的初始最大发射峰(λ_max)位于357.4 nm处，说明PPO的荧光团处于疏水环境中。HPP处理后PPO的荧光强度随压力的增加而逐渐减弱。特别是在600 MPa的HPP下作用50 min后，PPO的荧光强度降低了一半，同时发射峰在360.2 nm附近发生了红移，表明HPP引起PPO的去折叠，导致荧光基团暴露在极性较强的环境中，荧光团向外移动，导致荧光强度降低，三级结构遭到破坏。

PPO的活性中心分析

铜结合区是PPO活性中心的重要组成部分。随着模拟压力的增加，铜结合区逐渐扩散(Fig. 3a)。在200、400、600 MPa下模拟后，PPO的两个铜离子之间的距离分别由4.5 Å变为8.3 Å、8.5 Å和13.5 Å，表明铜离子很容易受到高压的影响。在0.1 MPa模拟条件下，PPO的Cu与His61的初始距离为2.1 Å，在200 MPa模拟后，其距离减小到1.7 Å，表明His61与Cu的相互作用增强。当模拟压力从0.1 MPa增加到400 MPa时，其他His残基与Cu之间的距离变化不大，其值在2.0 Å~2.2 Å之间。当压力增加到600 MPa时，Cu与His(His61，His94，His263，His296)之间的距离显著增加。特别是在600 MPa压力模拟后，PPO的Cu与His61、His296之间的距离分别从2.1 Å和2.1 Å增加到8.2 Å和6.6 Å。

活性中心附近铜结合区和疏水性的变化会引起活性口袋的变化(Fig. 3b)。与0.1 MPa下模拟的PPO相比，200 MPa下PPO的活性口袋变大。400 MPa和600 MPa下PPO的活性口袋变小并向内移动，特别是600 MPa下活性口袋移动到蛋白质中心。当压力高于400 MPa时，大量水分子进入PPO的活性中心，引起亲水性氨基酸残基嵌入蛋白质分子表面。在水分子的推动下，活性中心埋藏在聚集体中，阻碍了PPO与底物分子的接触，导致PPO活性下降。

PPO的底物通道分析

Fig. 4a中白色箭头从模拟开始时的零位置指向模拟结束时的位置，大多数白色箭头出现在环上，表明环在高压下受到严重影响。同时，环的运动趋势明显。与0.1 MPa下的PPO模拟区域相比，在200 MPa下，A-loop区域上移，类似于“开放”状态。当模拟压力增加到400 MPa时，B-loop区呈现向下移动的趋势，底物通道变窄。当压力为600 MPa时，loop移动更为明显。loop移动强度明显增大，相互缠绕，改变了loop控制通道的三维尺寸，使底物通道发生变形，类似于“关闭”状态。

Fig. 4b显示了PPO在0.1、200、400和600 MPa下的主成分分析（PCA）（PC1和PC2）的散点图。PCA进一步证实了PPO活性口袋和环的构象变化。在0.1 MPa时，各氨基酸残基移动不明显。在200 MPa时，PC1附近的散点较多，400 MPa时，PC2附近的散点较多。当压力增加到600 MPa时，散点同时分布到PC1和PC2上。为进一步说明压力引起的活性中心的变化，作者计算了不同压力下的协方差矩阵（Fig. 4c）。在0.1 MPa时，两者总体呈负相关，且随着压力的增加，更多的区域呈现正相关，特别是在600 MPa时，正相关主要分布在氨基酸残基序列220-240、260-280和355-365附近。这与RMSF的分析一致，loop区向内或向外折叠，使空腔环境暴露较少，有利于整体构象的稳定。

分子对接

采用分子对接方法对高压模拟后底物与PPO活性中心的结合情况进行了评价。Table 1显示四种压力水平下PPO的C-score值均大于4，说明对接结果有效可信。T-score得分越高，对接系统越稳定。PPO在200 MPa下的T-score值最高，其次是0.1 MPa、400 MPa和600 MPa。在200 MPa下模拟的PPO的Glu256、His259和His296参与了与邻苯二酚的相互作用，形成了平均距离为2.53 Å的三个氢键，如Fig. 5a所示。而在0.1 MPa、400 MPa和600 MPa下模拟的PPO只形成了两个氢键。当邻苯二酚与PPO对接时，邻苯二酚基团上的两个羟基通过氢键与多肽链上的氨基酸残基相连，形成酶与底物的复合物。在200 MPa下模拟的PPO具有更多的氢键数目。在0.1、400、600 MPa下模拟的PPO与邻苯二酚形成相同数目的氢键，但随着压力的升高，平均氢键距离从2.15 Å增加到2.70 Å。如Fig. 5c所示，200 MPa下模拟的PPO具有较大的底物通道，而600 MPa后模拟的PPO观察到较小的底物通道，这可能限制酶与底物的完全结合。

本研究作者采用分子动力学模拟和光谱实验相结合的方法，从分子水平上分析高压对PPO构象变化的影响，以探讨HPP激活和失活PPO的机理。在200~600 MPa压力范围内，均观察到HPP对PPO的活化和失活。模拟结果表明，高压降低了氢键的体积和数目，使铜结合区发生了明显的变化。200 MPa和400 MPa以上的高压引起了不同的活动中心和loop移动的变化。在200 MPa下，模拟PPO的Cu与His61之间的距离减小了0.4 Å，PPO的活性口袋暴露出来。在200 MPa下模拟的PPO的一部分环被上移，底物通道被扩展，有助于底物进入活性中心。600 MPa下模拟PPO中Cu和His之间的距离增加了6.1 Å，导致催化活性减弱。此外，由于大量的水分子进入PPO的蛋白空腔，活性口袋被嵌入蛋白中，降低了酶的催化作用。随着压力的增加，环的运动趋势处于无序状态，底物通道关闭，阻碍了底物与PPO活性中心的结合。分子对接发现，在200 MPa和600 MPa的压力下，PPO与邻苯二酚的亲和力分别最强和最弱，证明了高压对PPO结构和活性的影响之间存在相关性。PPO的光谱实验结果表明，HPP处理后二级结构没有明显变化，但氢键和三级结构被破坏。

整理：孙骁

文章信息：

PMID：34655831

DOI：10.1016/j.foodchem.2021.131243

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.131243