正确用脑方式（你真的了解它么）
正确用脑方式（你真的了解它么）时间节点：每个组织均选取来自6个时间节点-P4（出生后4天） P6（出生后6天） P8（出生后8天） P10（出生后10天） P14（出生后14天）及P180（出生后180天） ；组织部位：Dcdc2a-Gfp大脑皮层IgL（L5/6） L4和SgL（L2/3）；研究背景：大脑新皮层的组织分为六层，每一层都包含一组特有的细胞类型和突触连接，然而对于层间发育、功能的转录事件是未知的。研究目的：探索大脑皮层层间转录差异和他们的时序动态谱。1、实验材料
相较于一些低等的动物，哺乳动物的大脑皮层高度发达，并随着神经系统的进化而进化。高等动物一旦失去大脑皮层，就不能维持其正常的生命活动。人类的大脑皮层更产生了新的飞跃，有了抽象思维的能力，成为意识活动的物质基础。本文以鼠大脑皮层为研究材料带你深入了解大脑皮层的时空动态表达谱。
题目：Laminar and Temporal Expression Dynamics of Coding and Non coding RNAs in the Mouse Neocortex
杂志：Cell reports
影响因子：7.87
研究背景：大脑新皮层的组织分为六层，每一层都包含一组特有的细胞类型和突触连接，然而对于层间发育、功能的转录事件是未知的。
研究目的：探索大脑皮层层间转录差异和他们的时序动态谱。
一、材料方法1、实验材料
组织部位：Dcdc2a-Gfp大脑皮层IgL（L5/6） L4和SgL（L2/3）；
时间节点：每个组织均选取来自6个时间节点-P4（出生后4天） P6（出生后6天） P8（出生后8天） P10（出生后10天） P14（出生后14天）及P180（出生后180天） ；
样 本 数：12只鼠（雌雄各半），6个时间点，每个时间点3个，组织共计36个样本；
2、测序方法及数据量
Illumina TruSeq ：mRNA miRNA SE 75nt
二、研究结果1、数据产出、质量评估
层流显微切割术获取组织精准度验证
a.为了确定层流显微切割的精准度，作者基于已知的特异皮层Marekr（Cux1、Rorb、Fezf2）进行了qRT-PCR验证，说明3个组织中均有表达，且表达量不同，如B图；
b.将mRNA的测序reads映射到Gfp测序序列上，L4样本始终高表达，与Gfp可以用于L4组织的区分相一致，如C所示；
c.基于RNA-seq数据结果，选取一系列已知的特征marker绘制聚类热图，用于确认皮层组织的特异性，如D所示。
数据产出及比对统计：
数 据 量：mRNA-611M miRNA-143M 平均每个样本＞10 M
比对结果：mRNA测序结果经比对唯一比对占约70.5%，每条reads的mismatches 低于2%，平均每条常染色体紧约3%发生转录，性染色体略低，而线粒体有70%被转录。基于唯一比对的reads进行外显子分析，结果常染色体有50%的外显子转录，x-染色体有38%外显子转录，y-染色体有35%转录，线粒体有70%。整体统计发现，在mRNA测序结果中外显子占了88.6%，仅有4.1%的reads比对到已知编码基因的内含子上，其余的7.3%的reads比对到内含子区域上，暗示了新的转录本的转录（包括lincRNA）。
鉴定结果：本研究共鉴定12729个编码蛋白的基因（RPKM≥1，且至少在2个样本中出现）和436个miRNA（每个miRNA至少有10条reads支持，且至少在2个样本中出现）
对于TOP 10（80%的reads比对）表达的miRNA进行分析，分属于8个基因家族（let-7 mir-25 mir-125 mir-28 mir-151 mir-127 mir-181和mir-486 ）。
为了评估样本的差异性和相似性，作者进行了PCA分析，结果显示：
基于mRNA数据：第一主成分PCA1与年龄层相关，第二主成分PCA2与层位有关；
基于miRNA数据：年龄层与层位对于miRNA的贡献率较小，如下图所示：
2、mRNA和miRNA的时序性分析
经差异分析（DESeq FDR≤0.01），无论是基因还是miRNA大部分差异的都是与时序相关，对于miRNA层位影响相对弱，结果与PCA一致。
差异基因功能富集分析：
时序相关基因主要注释到细胞膜、突触、细胞连接相关的分类中，主要参与钾离子运输和离子通道活性；层位相关的基因主要注释到与细胞调控、血管发育、神经元分化；共有的基因注释到神经元发育、突触、细胞信号相关条目中。
3、可变剪接分析
类似差异分析，可变剪接的分析分成3种类型：时序相关、层位相关及两者共有的可变剪接。作者重点分析了一种与时序相关的基因Dlg2的可变剪接，该基因已知的可变简接本有3个。小鼠出生一周后，检测到该基因的可变剪接类型是已知类型中的1和3，均是跨越一个外显子，研究中称之为exon-X，可变剪接体2被称为exon-9，同时检测到跨越exon-9到另一个外显子的剪接体，我们称之为exon-Y。在P6时期我们检测到了连接exon-X和Y的连接位点，该种可变剪接在P14时期为主要可变剪接形式，且在成鼠期是该基因的唯一的可变剪接体。经PCR验证，X-9-Y 和X-Y可变剪接体表达模式相反。
DLG2作为编码编码突触密度的蛋白，是PSD-93（MAGUK ）家族的一员。对于X-9-Y完整的结构是未知的，所以功能上是不可确定对的，但是该可变剪接本比对到了DLG2的isoform 1上，改位点是hook和GK蛋白的保守结构域位置，该位置参与MAGUK的亚细胞定位。近期也有报道称还种模式的可变剪接可以调控神经元突触的成熟。
4、层位和发育相关的特异性共表达网络分析（WGCNA）
模块划分及聚类分析
采用WGCNA的分析方法，共鉴定得到40个显著性差异的时空相关特征模块，如下图。每个模块的时空模式由模块的轨迹（特征基因值）来体现，特征基因是根据年龄而绘制。其中M40(n=14个基因) 的功能基因与性别相关。
针对于其余的39个模块研究者进行了层次聚类热图分析，39个模块基因被聚类成5个簇（如下图），其中cluster I和cluster v与时序相关，簇中的基因集随着时间的推移而表达分别增加和降低。其余三个簇与层位相关，基因集在不同的层位上表达模式不同，但不随时间的变化而变化。（cluster II is IgL enriched cluster III is SgL enriched and cluster IV is L4 enriched ）。
共表达网络功能注释分析
a.基因功能富集分析显示：很大一部分基因的组合在一个给定的模块是与一个特定的生物过程关联。且这种显著性富集不只一个模块，如cluster III 模块中的M5和M7经注释与血管发育相关，M5的基因注释到与血管生成的初级阶段相关（Notch1 Robo4 and Angpt2 ），而M7的基因与血管生成的后期相关（Tek and EphB4 ）。
b.组织中不同细胞类型分析：
由于所测的组织样本中包括多种细胞类型，那么40个模块分成的基因簇是否与特异的神经细胞类型基因表达相关？接下来研究者进行了相关分析：研究者将40个模块依据基因列表分割成3种细胞类型（依据前人研究的与神经元细胞、少突细胞与星形细胞相关的6000个基因），结果每个模块都是倾向于某一特定的神经细胞类型。M5和M7的基因富集到星形细胞类型上，与星形细胞和血管发育的互作相一致。cluster II （IgL enriched ）和cluster IV （L4 enriched ）的基因富集结果注释倾向于少突细胞和神经元细胞。
a.
对cluster II 、cluster III和cluster IV进行基因富集分析，结果如下图所示：cluster III
星形细胞比例最高，成熟星形细胞和未成熟星形细胞在各簇所占的比例与大脑皮层的
发育相一致。
c.对每一个模块的TOP 10 hub基因的连通性及每个簇的不同模块进行分析：
结果显示对于特定类型的细胞内基因的连通性显著高于与其他类型细胞的基因的连通性，暗示着一些模块与不同神经细胞类型的发育相关。有连通关系的模块间也可以发生在不同的细胞类型中，比如cluster II 中的M13中的基因与M27的4个hub基因（Slc25A22 Tmem163 Trbj2-3 and Sema5A ）M31的2个hub基因是高度连通，如下图：M13（神经元细胞）的基因富集注释到与神经元分化的行为及细胞形态发生相关，而M27（少突细胞）的基因富集注释到少突细胞发育相关。M27的4个hub基因中的Sema5A基因富集到IgL中，前人研究报道与少突细胞的早期发育相关。Sema5A在M27和M13中均得到富集，说明在少突细胞和神经元细胞中该基因均其作用。结合前人的报道，Sema5A在不同的组织有不同的作用。也说明Sema5A在不同的模块中，随着大脑皮层的发育具有多效性。
5、miRNA-mRNA互作分析
基于转录组数据，利用mRNA的3’UTR序列互补，采用targetscan软件进行靶基因预测。使用lasso_mir.R软件预测miRNA-mRNA Interaction（rank score≥80），针对于miRNA-mRNA Interaction pairs，选择TOP负相关的Paris进行深入研究。
分析发现有32个miRNA优先靶向时序模块相关的cluster I和cluster V中的基因，8个miRNA优先靶向层位模块相关的cluster II到cluster IV中的基因。研究者对于最可靠表达的miRNA进行深度分析，以提供pairs关系的可靠性。选择其中的miR-92b进行分析，该miRNA有119个负调控的靶基因，这些靶基因主要富集在IgL cluster中（cluster II）神经元细胞和少突细胞且miR-92b与其靶基因呈现出强烈的负相关。
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