westernblot实验步骤操作图（WesternBlotting技术之电泳）
westernblot实验步骤操作图（WesternBlotting技术之电泳）电场强度凝胶组成和强度（聚合物的重量百分比）影响蛋白质迁移的因素包括：
技术术语“电泳”是指带电分子在电场力作用下在溶液中的运动。电泳已发展成为一种标准的分子生物学实验室技术，在电场作用下，不同分子量/电荷的分子以不同的速率通过介质泳动，从而实现不同分子之间的分离。
在电场中，蛋白质向带相反电荷的电极移动。蛋白质具有各种大小和形状，并具有和其氨基酸组成相关的电荷。不同的蛋白质具有其特征性的迁移速率。在水性介质中蛋白质的总电荷取决于其酸和碱的离子化程度，其总电荷可以通过缓冲液来控制。因为蛋白质的质量是恒定的，所以其荷质比就会随缓冲液而改变。蛋白质构象也可以通过缓冲液、除垢剂和氧化/还原剂来改变。这些因素可将蛋白质迁移率的差异调整到一定程度，以增强分离效果。在蛋白质电泳中，蛋白质移动通过水性聚合物凝胶中的孔洞，这些凝胶中的孔洞对蛋白迁移产生影响，并将蛋白保留在凝胶中，以便对其进行成像和分析。蛋白质在凝胶电泳中的移动速率取决于电泳系统的性质和蛋白质本身的性质。
影响蛋白质迁移的因素包括：
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凝胶组成和强度（聚合物的重量百分比）
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电场强度
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温度
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蛋白质的大小、形状和电荷
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缓冲液pH，离子类型和浓度
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添加除垢剂或还原剂
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）概述
几乎所有用于蛋白质分离的方法都使用水性聚丙烯酰胺凝胶作为尺寸选择筛。聚丙烯酰胺凝胶就是该技术的名称来源：聚丙烯酰胺凝胶电泳或简称PAGE。当蛋白质在电场力作用下移动通过凝胶时，凝胶的孔结构允许较小的蛋白质以更快的通过，较大的蛋白质则更慢通过。较大和较小蛋白质之间迁移速率的差异就导致了它们在凝胶中的物理分离。
在大多数PAGE实验中，凝胶位于两个缓冲液室之间，并且两个缓冲液之间的唯一电场通路就是凝胶。通常，凝胶垂直放置，因此也称垂直电泳，凝胶在浇铸时采用梳子形成上样孔。在缓冲液室之间施加电场会迫使蛋白质迁移进入凝胶并在凝胶中泳动。通常，通过在样品中添加染料来目视跟踪蛋白质在凝胶中的移动，可以看到随时间的推移，染料在凝胶中的向下移动。如果凝胶电泳时间过长，蛋白质可能会从凝胶上流出。
非变性PAGE
非变性PAGE是一种在非还原性、非变性样品缓冲液中电泳分离蛋白质的方法，而且电泳在不存在变性剂和还原剂的情况下进行。由于保留了天然的质荷比，蛋白质迁移率由多种因素综合决定。另外，蛋白与蛋白之间的相互作用在分离过程中得以保留，因此某些蛋白质也可能会以多亚基复合物的形式一起迁移，并以不可预测的方式移动。由于保留了天然电荷，蛋白质会根据其电荷向不同电极方向迁移。
SDS-PAGE
该方法将除垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）掺入缓冲液中，目前SDS-PAGE已成为蛋白质电泳的最主要形式。蛋白在SDS和变性剂（如还原剂）共同作用下会打开二硫键，并完全解离。此外，SDS与蛋白质非共价结合，赋予了一些新的特征，这些特征有利于蛋白的电泳分离：
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由于SDS带负电，因此可以掩盖蛋白质的固有电荷，并为蛋白质提供整体负电荷
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所有蛋白质的荷质比相似，因为SDS以每克蛋白质1.4克SDS的恒定比例结合
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蛋白质呈长杆状，而不是复杂的高级构象
结合SDS的蛋白质在凝胶中迁移的速度主要取决于其大小，从而可以根据凝胶中的单独条带位置估算蛋白质的分子量。
电泳功率设置
电泳过程中需要电源保持一个参数恒定（电压，电流或功率），而电阻在电泳程中不会保持恒定：当不连续的缓冲离子前沿穿过凝胶时，电阻就会发生变化。在SDS-PAGE中，电阻随着运行的进行而增加。
恒定的电参数设置以及对应的缓冲液体系，会可能导致凝胶在运行过程中热量增加，也有可能会减少。所以，在长时间无人值守的电泳过程中有可能需要使用外部冷却，合适的温度控制会产生均匀及重复的电泳结果。
恒电压
如在整个电泳过程中电压保持恒定，则电流和功率（热量）会随着电阻的增加而降低，同时导致运行时间增加，而蛋白条带有更多的时间扩散。但随着温度的降低，扩散速率随温度的降低也会抵消掉这一点。当并行运行多个凝胶时，通常首选使用恒电压，以确保凝胶上施加的电压是明确可控的。
恒流
如果电泳期间电流保持恒定，那么电压、功率及凝胶的热量则在运行期间增加。恒流运行比恒压运行时间短但凝胶温度高。热量的增加加快了蛋白条带的弥散速度，如不进行额外制冷，会导致条带的弥散。
恒功率
保持电泳功率恒定可将凝胶过热风险降至最低。某些品牌/型号的电源不提供这种恒功率控制模式，一些凝胶制造商也不一定提供恒定功率的建议设置。
电泳技巧
洗净上样孔
在加样之前，用移液枪从上缓冲液室吹洗每个上样孔。这有助于洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣，避免畸形条带的出现。
避免凝胶过热
如果凝胶在电泳过程中温度过高，则条带可能会出现“微笑”形状，即条带两侧向上弯曲的现象。如果缓冲液使用不当，电泳功率过高，都可能使凝胶过热。
确保样品缓冲液离子强度正确
样品中的盐离子强度过高（或过低），都会导致条带出现偏斜或扭曲。
不要过载上样
加大上样量有利于检测到稀有目标蛋白。但是，过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。对于较大的上样量，可将电泳电压降低 25％，有助于减少条纹。
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