豌豆基因遗传图解（探寻涡虫的遗传秘密）
豌豆基因遗传图解（探寻涡虫的遗传秘密）他的这一发现并非偶然，要从十几年前的博士生涯开始讲起。故事很长，但很有趣。6月1日，郭龙华关于涡虫的最新研究在Nature正式上线，他发现地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）1号染色体上富集了众多与生殖系统发育相关的基因，表现出性染色体的特征和功能。这一发现为研究性别决定的演变提供了一个绝佳的机会。透过有性涡虫，我们得以一窥性染色体演化的最早期的秘密。编者按涡虫是研究器官再生的极佳模式生物。1766年，普鲁士动物学家Peter Simon Pallas 首先记录下淡水涡虫令人惊奇的再生能力，拉开了涡虫再生研究的序幕。200多年来，无数研究者利用涡虫，构建出了一个庞大系统的研究体系。然而，在过去的200年里，这个系统里没有遗传学。本文的主人公郭龙华便是这涡虫研究大军中的一员，他曾是加州大学洛杉矶分校遗传学的博后，如今已在密歇根大学建立了自己的实验室，未来研究将集中于衰老
6.12
知识分子
The Intellectual
涡虫是研究器官再生的极佳模式生物| 图源：istockphoto Sinhyu
编者按
涡虫是研究器官再生的极佳模式生物。1766年，普鲁士动物学家Peter Simon Pallas 首先记录下淡水涡虫令人惊奇的再生能力，拉开了涡虫再生研究的序幕。200多年来，无数研究者利用涡虫，构建出了一个庞大系统的研究体系。然而，在过去的200年里，这个系统里没有遗传学。
本文的主人公郭龙华便是这涡虫研究大军中的一员，他曾是加州大学洛杉矶分校遗传学的博后，如今已在密歇根大学建立了自己的实验室，未来研究将集中于衰老和再生领域的前沿问题。从他09年赴美读博至今，已经与涡虫打了12年交道。
6月1日，郭龙华关于涡虫的最新研究在Nature正式上线，他发现地中海涡虫（Schmidtea mediterranea）1号染色体上富集了众多与生殖系统发育相关的基因，表现出性染色体的特征和功能。这一发现为研究性别决定的演变提供了一个绝佳的机会。透过有性涡虫，我们得以一窥性染色体演化的最早期的秘密。
他的这一发现并非偶然，要从十几年前的博士生涯开始讲起。故事很长，但很有趣。
撰文 | 黄宇翔
责编 | 王雨丹
● ● ●
一个惊奇现象的发现
（2009.9-2013.1）
01
2009年1月，盐湖城。
一下飞机，山顶白雪皑皑的落基山脉立刻映入眼帘，视野开阔的自然风光令郭龙华心旷神怡。
两天后，在完成与 Alejandro Sánchez Alvarado 教授的面试之后，郭龙华立刻接受了犹他大学生物学系博士项目伸出的橄榄枝，决定在落基山脉沃萨奇岭山脚下开展自己的博士研究。
除了优美自然景色的吸引，郭龙华选择犹他大学，还因为在这里能够研究一种独特的实验动物——淡水涡虫（Planarian）。
02
在传统的动物分类学上，淡水涡虫隶属于扁形动物门涡虫纲三肠目，广泛分布于世界各地。
1766年，普鲁士动物学家 Peter Simon Pallas 首先记录下淡水涡虫令人惊奇的再生能力，拉开了涡虫再生研究的序幕。[1]
19世纪，美国发育学家 Harriet Randolph 对涡虫的再生能力展开系统研究，发现经过切割后的涡虫，身体的每一部分竟然都能重新发育为一个完整的涡虫个体。她由此推测，涡虫全身遍布着一类具有高度分化潜力的多能干细胞，并将其命名为 “Neoblast”。[2]
在 Harriet Randolph 工作的影响下，另一位美国发育学家 Thomas Morgan 也对涡虫再生的问题产生了兴趣，他将一只涡虫 “千刀万剐” 成了279个碎片，惊讶地发现涡虫在如此情况下一些身体碎片依然能够重新再生出结构完整的个体。[3-6]
Morgan在发表了数篇对于涡虫再生的研究之后，发现无法深入地窥见再生的机理。于是转而研究果蝇。于是，开启了遗传学的世纪。Morgan也成为孟德尔之后的历史上最伟大的遗传学家之一：发现了染色体是生物性状遗传的本质。由此，才会有后来的DNA双螺旋的重要性。
图1 19世纪发育生物学家Harriet Randolph和Thomas Morgan关于涡虫强大再生能力的记录 | 图源[12]
随着二十世纪遗传学的兴起，凭借在研究基因调控机制方面的便利，以果蝇为代表的模式生物一跃成为推动发育生物学发展的领军者，而涡虫领域的研究者们则由于缺乏遗传学手段而导致将认识深入到分子水平的脚步受到了限制。虽然在日本和欧洲还有部分研究涡虫的实验室，但所做的工作还未能在分子水平上有质的突破。
直到二十世纪末，Alejandro Sánchez Alvarado首先将RNA interference（RNAi）引入了涡虫再生领域：在众多的涡虫物种中，他将精力投入了一种栖居于撒丁岛的地中海涡虫（S. mediterranea）——相对于其他种类的淡水涡虫，地中海涡虫最大的优点便是稳定具有四对同源染色体，这一遗传特点将有利于研究者对其基因功能展开细致的研究。
图2 地中海涡虫 | 图源：wikimedia Alejandro Sánchez Alvarado
在1999到2009年的十年中，Sánchez Alvarado 实验室完成了对地中海涡虫基因组的初步测绘与基因克隆，并且借助RNAi技术研究了一些演化上保守的基因在涡虫发育再生过程中的功能。[7-11]
但直到郭龙华申请博士项目的2009年，涡虫的遗传学依然没有人研究。纵观整个北美大陆，在当时开展涡虫研究的实验室也仅有四个。
03
硕士期间，郭龙华在军事医学科学院贺福初老师的指导下，通过生化手段对肝脏再生过程中的蛋白组学变化进行研究，这段经历激发了他对于器官再生现象背后的复杂机制的好奇。在对再生领域进行了深度的文献阅读之后，他终于找到了自己的答案：在现有的再生研究系统中，从小鼠的视网膜神经节再生到线虫的运动神经元轴突再生，再到斑马鱼的尾鳍再生，无一能与涡虫那逆天改命的再生能力相提并论。而这些系统都有强大的遗传操作能力——因此，在涡虫系统中运用分子遗传手段解析再生原理就是最吸引他的研究方向。
此前，还没有任何实验室建立起地中海涡虫稳定的有性繁殖系统。于是，当郭龙华在2009年秋天加入 Alejandro Sánchez Alvarado 实验室时，他的第一项任务就是摸索如何能让地中海涡虫在实验室中完成交配产生小涡虫。
04
不同于哺乳动物，地中海涡虫同时具有两种性器官，属于雌雄同体生物。因此尽管被人为切碎后，身体碎片依然能再生出完整涡虫个体。但人们推测，自然环境下地中海涡虫依然能够通过减数分裂的形式产生精细胞和卵细胞，两只涡虫交配完成受精产生出后代，以此来提高种群的基因多样性。
但在漫长的演化之路上，不知何时何故，一部分地中海涡虫的1号染色体的一部分与3号染色体的一部分位置发生了交换（遗传学上称作染色体异位），使得这些地中海涡虫失去了有性繁殖的能力，但却能通过主动地将自己分成数份的方式，来实现对自身遗传物质的复制与传递。[12] 因为自身的再生能力，这些分裂产生的片段能够再生成为新的个体，从而完成群体的繁衍。
图3 地中海涡虫（S. mediterranea）具有稳定的核型。上方为有性繁殖品系的核型，下方为无性繁殖品系的核型。可以看出无性繁殖品系的1号与3号染色体之间发生了异位。
所以，地中海涡虫其实有两个品系。其一是无性繁殖的个体，其二是有性繁殖的个体。目前认为这两者之间因为稳定的染色体易位和突变，无法产生互换。
无论繁殖方式如何，两类地中海涡虫都具有超强的再生能力。
对于地中海涡虫的演化来说，无性繁殖无疑削减了物种内部基因交流的机会，在时间的长河里大概率是件祸事；但对于研究涡虫再生原理的研究者来说，地中海涡虫能进行无性繁殖却是件幸事，因为这帮助涡虫研究者们大幅简化了培养涡虫的流程，让培养涡虫变得像在培养皿中养一盘细菌一样轻松便利。无性繁殖的地中海涡虫也的确足以帮助研究者回答许多重要的科学问题，比如具有超强分化能力的Neoblast细胞究竟有何特殊之处、破坏特定基因的功能究竟如何改变涡虫的再生能力等等。
* 编者注：
Neoblasts是涡虫成体体内唯一具有增殖和分化能力的多能干细胞的统称，是其损伤修复和再生的细胞基础。
但无性繁殖系统的内在特性，却也限制了分子遗传学工具施展拳脚的空间。
比如说，果蝇研究者借助UAS-GAL4系统，可以轻松地通过交配特定基因型的果蝇，对某一特定类型的细胞进行标记和改造。而这在无性繁殖的体系中要想实现则非常困难。
在过往的十年中，Alejandro Sánchez Alvarado 实验室曾经有研究生尝试走出舒适圈，但却遗憾地发现不知什么缘故，养在实验室的地中海涡虫产卵率极低，最终遗憾止步。而在几乎同样的条件下，另一个涡虫物种 Schmidtea polychroa 就能够自发地产生大量的后代，但由于其孤雌生殖的特性和多倍体的核型而无缘分子遗传学工具的开发。[13]
一旦能在有性生殖的地中海涡虫中建立起高效的分子遗传学工具，无疑将会开拓出一大片涡虫生物学所能探索问题的新天地。
05
1999年8月末，Alejandro Sánchez Alvarado 收到了一个来自意大利萨萨里大学 Maria Pala 教授寄来的小盒子。盒子表面上还残存着运输过程留下的冰霜。打开盒子，清澈的水中游动着五十来只地中海涡虫——Maria Pala 教授醉心于研究这一具有超强再生能力的神奇物种，在地中海各地采集涡虫进行研究，此番应 Alejandro Sánchez Alvarado 的请求，慷慨地赠送了自己团队在撒丁岛野外辛苦采集所得的有性繁殖型野生地中海涡虫。
Alejandro Sánchez Alvarado 的博后 Peter Reddien 将一只涡虫反复切断诱导再生，获得了一群理论上基因信息完全相同的克隆涡虫，命名为 “S2克隆系”。在 Peter Reddien 离开团队到麻省理工学院自立门户之后，实验室的管理员便接手了这批虫子。
涡虫的生存能力极强，在水中饿上一个月虽然体型会显著缩小，但只要恢复食物供应就能重新焕发活力。因此只要定期给涡虫投喂一些食物，特定的克隆系就能顺利保存下来。
因此，当郭龙华在2009年秋天开始尝试对地中海涡虫繁殖条件进行优化时，不仅有实验室前人分离出的 “S2克隆系” 可供使用，还有 Maria Pala 教授的小盒中那五十来只当年那批从撒丁岛采集来的地中海涡虫——涡虫的寿命极长，所以它们在实验室生活了十年后依然生龙活虎。
因此，郭龙华一边尝试诱导 “S2克隆系” 的涡虫们进行繁殖，一边从 Maria Pala 教授的小盒子中的其他涡虫个体中分离新的涡虫克隆系。
郭龙华首先探索了培养温度、光照周期等环境因素对于涡虫产卵率的影响，但令人失望的是，无论如何变化诱导条件，培养皿中已经达到性成熟的涡虫就是不进行交配（郭龙华为此还专门安放了摄像头对涡虫们的性生活进行了全天候的 “监视”），自然也不会产生幼虫。
涡虫会不会存在能激发性欲的激素呢？通过基因序列比对，郭龙华发现，哺乳动物中由下丘脑产生的促性腺激素分泌激素（GnRH gonadotropin-releasing hormone）在地中海涡虫的基因组中也存在相似的同源基因。为此他分别克隆表达了在包括地中海涡虫在内的多种生物的GnRH激素，希望能激起手中这些涡虫们的繁殖欲望。
但令他失望的是，无论是直接体内注射，还是在涡虫生长环境中添加GnRH激素，涡虫们一个个依然心如铁石、不为 “色” 动。
将近一年的时间过去了，到了2010年夏天，郭龙华依然在为地中海涡虫们对于绵延子嗣的消极态度而操心。
06
中国有一句俗话：“饱暖思淫欲。”
郭龙华留意到，由于地中海涡虫们实在过于 “耐饿”，因此以往的涡虫研究者在饲料投喂方面并不太上心，至少实验室管理员在维持那些长期储存的涡虫时基本是奉行了 “只要饿不死就行” 的喂食策略。
但历来如此，就一定最合适吗？
对涡虫们的喂食频率进行控制后，郭龙华发现，只要涡虫们能每周稳定地获取一次食物补给，就立刻有了交配的兴趣。
原来，相比于其他的环境因素，食物的供给才是影响地中海涡虫繁殖效率最主要的因素。
于是地中海涡虫在实验室中的繁殖问题得到了解决，郭龙华很快就勾勒出了地中海涡虫生活史的特征：大部分涡虫会在交配约一周时间后产下数个卵囊（egg capsules），再经过两周之后每个卵囊中会孵化出一到十只幼虫，在获取稳定食物的情况下，幼虫经过六周左右的时间会发育至性成熟阶段。因此算下来一只涡虫从产卵到发育成熟的生长周期只需要两个月出头的时间，这同小鼠和斑马鱼相似，但是便宜很多。
利用涡虫惊人的再生特性，郭龙华可以将一只涡虫拦腰截断，然后让两段身体分别再生出的涡虫交配繁殖出小涡虫——如果地中海涡虫有性繁殖的遗传方式与哺乳动物相同，那么这只小涡虫会随机得到父母各自一半的遗传物质。这种实验室中的杂交操作甚至已经超出了 “近亲繁殖”，因为小涡虫的 “父母” 来源于同一条涡虫，基因组成分在理论上是完全一致的。因此，即使最初的那只涡虫两个同源染色体上的基因序列存在差异（在遗传学上称作 “杂合” 现象），那么按照孟德尔遗传定律，在经过郭龙华多代杂交之后，子代涡虫两个同源染色体上大部分的基因序列应该完全相同（遗传学上称作 “纯合子”）。
最终，郭龙华从一只 “S2克隆系” 出发，培育出了这只涡虫的十代重孙，形成了 “十世同堂” 的奇观谱系（图4）。
图4 郭龙华在 “S2克隆系” 中构建出了壮观的“十世同堂”遗传谱系 | 图源[14]
此时 Alejandro Sánchez Alvarado 应Stowers研究所的盛情邀约，已经将实验室搬到了堪萨斯州。
那么问题来了，如何通过实验证据，来检验地中海涡虫是否也同我们一样遵守孟德尔遗传定律呢？
07
当年，孟德尔之所以能通过豌豆杂交实验发现遗传定律，很大程度上要感谢他所使用的研究系统——豌豆。
孟德尔将豌豆的种皮颜色、种子的饱满程度等这些可以直接人为观测的现象称作 “性状”。今天我们知道，孟德尔的幸运之处在于，每一个他所观察的性状恰好都是由一对等位基因所决定的。因此通过统计特定性状在子代豌豆中出现的比例，孟德尔得以推测出决定性状的 “遗传物质” 从亲代向子代传递的规律（孟德尔的年代还没有 “基因” 这一概念）。倘若孟德尔选择观察的性状由多组基因共同决定（比如人的身高），那恐怕他很难对实验结果进行解释。
得益于分子生物学技术的发展，郭龙华无须重走孟德尔的老路——从 “性状” 上判断遗传信息传递的规律。在现代测序技术的帮助下，郭龙华能直接 “读取” 基因组上的序列信息，找出同源染色体上存在差异的序列（即上文提到的 “杂合子”），然后观察这些杂合子序列在亲子代之间的遗传特征。根据孟德尔遗传定律的预测，如果这些杂合子序列编码的蛋白不影响正常的受精和发育，那么应该可以观察到：纯合子和杂合子在子代个体中各有一半的概率出现。
那么该如何从涡虫的基因组中 “找出” 这些杂合子序列呢？郭龙华将精力集中在了一类被称作“单核苷酸多样性”（single nucleotide polymorphisms 下文简称 “SNP”）的特殊杂合子序列上——SNP是指一对同源染色体上在特定位置发生了碱基替换。值得注意的是，SNP所在的位置未必在基因内部，即使是存在于某个基因中，也未必会对最终编码出的蛋白的功能造成重要影响。但对于郭龙华探索地中海涡虫遗传特征的实验目的而言，这些SNP在亲子代间出现频率的变化已经足够为他的科学问题提供答案。
郭龙华利用RNA深度测序的办法来寻找涡虫基因组中的SNP位点。RNA深度测序是首先提取出细胞的RNA，经过逆转录获得互补DNA后测得序列。
既然找到一部分SNP就足以对涡虫的遗传规律进行检验，因此郭龙华根据自己的实验目的，选择对 “十世同堂” 谱系中一只第六代涡虫（记作F6）和它的十只子代们（计作F7）进行RNA深度测序。
请读者朋友们想象，假若其中一组SNP在F6涡虫中存在A和B两种形态，如果涡虫的遗传遵从孟德尔定律，那么在众多的F7涡虫中，该SNP位点的基因型有25%的概率为A/A，50%的概率为A/B，25%的概率为B/B。但是这个概率的计算传统上需要很大的样本量（100-200以上）。
因为是在11只涡虫中用三千个SNP检验孟德尔遗传，按照传统的卡方检验方法，11这个样本量太小了，所以郭龙华利用的是更为可观的SNP数量的优势。他检验了这三千个位点在11个涡虫中基因型的分布。如果符合孟德尔遗传规律，这些位点中杂合和纯合状态在11个个体中的比例的分布应该符合正态分布。
实际情况是，那些可以从F6杂合变成F7纯合的位点确实符合预期。但是从F6杂合到F7杂合的位点所占比例过高了！完全违背了孟德尔遗传的预期！三千位点中60%在全部11个个体中都是杂合。
接下来，郭龙华从三千多个候选SNP精心挑选了7个，在 “十世同堂” 谱系中运用传统分子生物学的 “PCR 桑格测序” 方法进行验证。
但在郭龙华所挑选的7处疑似存在SNP的位点之中，有4处符合孟德尔定律的预测，另外的3处却有悖于孟德尔定律，在F7中全部表现为A/B的杂合体状态，验证了前期的分析。
这是怎么回事呢？
为了检验这一杂合体稳定遗传的现象是否是涡虫基因组中的普遍现象，郭龙华不惜破费，对F0 、F 2、F6、F8四代涡虫进行了DNA深度测序。结果令他大为震惊：经过了8次杂交，竟有70%在F0中表现为杂合的SNP位点在F8中依然全部以杂合形式存在。并且这些SNP位点并非聚集于基因组的某一个特定区域，而是广泛地分布于大约3亿碱基对的基因组空间中（占到了涡虫全基因组的37.5%）。
图5 郭龙华发现70%的SNP位点存在稳定杂合遗传的现象 | 图源[14]
难道说，他发现了一个孟德尔定律的例外现象？
08
这一杂合体稳定遗传的现象，会不会是由于在实验室十几年养殖而被人为引入的变异呢？
为了检验这一可能，Alejandro Sánchez Alvarado 和郭龙华两人于2015年初来到 “S2克隆系” 的原产地撒丁岛进行科考，探究生活在自然环境中的地中海涡虫是否也存在杂合体稳定遗传的现象。
基于DNA深度测序的实验结果，郭龙华将82个SNP序列刻入了一个DNA芯片，然后提取野生涡虫的DNA，加入芯片中检测其在相应位点SNP的基因型（杂合？纯合？）。
郭龙华一行在撒丁岛北部三处互相距离数十公里的区域，采集了几十只野生地中海涡虫，经过DNA芯片检验后，他们惊喜地发现，有39处不符合孟德尔遗传的SNP位点在全部的野生地中海涡虫中都以杂合体的形式存在！
这究竟是单纯巧合使然？还是背后有演化力量在推动？
郭龙华和 Alejandro Sánchez Alvarado 此时已经意识到，他们在不经意间可能已经从分子遗传学踏入了演化生物学的世界，有机会为一个著名的演化理论提供最新的阐释！
09
基因的多样性对于维持物种生存至关重要，而有性繁殖方式的产生大幅提升了物种内部基因交流的机会，使得整个物种能更好地应对环境变化所带来的挑战。
但倘若一个物种在物理上被分隔在了一个很小的区域，近亲繁殖就变得不可避免。一种演化生物学观点认为，长期近亲繁殖的物种最终必将走向灭绝。对于涡虫而言，强大的自我再生能力和较弱的长途迁徙能力，使得近亲繁殖的频繁发生在其演化道路上似乎不可避免。
那为什么经过数亿年时间的洗礼，地中海涡虫依然在撒丁岛上生生不息地繁衍着。这背后，是否蕴藏着某种能够抵抗近亲繁殖劣势的神秘力量？
也许，答案就隐藏在地中海涡虫基因组中那些 “顽固” 绵延的杂合体之中。
一个初步模型的提出
（2013.1-2016.7）
01
2013年初，郭龙华已经通过对四代 “S2克隆系” 涡虫的DNA深度测序，发现有多达70%的SNP位点会稳定地以杂合体的形式进行遗传。
这一发现很自然地引出了两个新的问题：首先，这70%杂合遗传的SNP在染色体上是均匀分布的吗？尽管DNA深度测序结果已经表明，这些SNP覆盖涡虫37.5%的基因组区域，但此时涡虫基因组的数据仍然是一个个零散的 “片段”，尚未经过系统的组装。换句话说，当时人们对于涡虫基因组的理解还停留在 “单丝不成线” 的阶段，因此郭龙华所发现的杂合遗传位点在染色体上的定位依然不得而知；其次，究竟是什么生物学机制导致了涡虫中如此大范围的杂合遗传现象？在细胞水平上，这些位点的杂合偏好是发生在受精过程之前，还是受精之后的胚胎发育过程？回答这些问题无疑会增进我们对于生物发育机制的理解。
对于第一个问题，即使花费了很多精力，但直到2016年初郭龙华也没能得到一个满意的答案。
02
对于第二个问题，郭龙华从2013年开始对一系列假说进行了检验。
该如何解释稳定遗传的杂合现象呢？也许聪明的读者首先猜到的一种可能机制是：之所以在发育完全的子代涡虫中只能观察到杂合体，是因为基因型为纯合的受精卵存在发育缺陷，在胚胎期就提前夭折了。检验这一可能的方法也很直接，郭龙华在涡虫交配产下卵囊后解剖卵囊，通过组织染色的方式，分析在不同天数中发育速度停滞的晚期胚胎数量。
统计的结果表明，胚胎发育停滞的数量要远低于正常孵化出的幼虫数量，这提示：在胚胎发育晚期就已经是以杂合形式存在的了。
另一种可能性是：包含杂合遗传区域的基因片段，在地中海涡虫的基因组中发生了 “基因复制” 变异（gene duplication）。具体来说，就是在一个同源染色体上同时包含 “A” 和 “B” 两份拷贝，两个同源染色体实际上已经在杂交过程中实现了纯合，涡虫实际的基因型是 “AABB/AABB”，因此被深度测序 “误认为” 是杂合体。
要想检验这一可能性，需要对涡虫的精细胞和卵细胞分别进行测序。如果在单倍体的精细胞和卵细胞中也能检测出杂合体的存在，那就说明郭龙华所观察到的杂合遗传仅仅是基因复制变异所带来的一种假象。
在2016年年初，郭龙华终于收获了对 “S2克隆系” 11个精细胞和15个卵细胞单细胞测序的实验结果。
很明显，之前郭龙华所观察到的杂合遗传现象并非来自 “基因复制”：所有测得的生殖细胞在每一处杂合遗传的位点都只包含一种SNP。
更为有趣的是，郭龙华发现这些SNP位点彼此之间还存在着“高度绑定”的奇妙现象：如果一处杂合遗传位点的SNP确定了，在其他几百个位点的SNP也可随之确定。它们就像是一组训练精良的部队，一人向前（某个位点的SNP类型定下来），其他的几百人也一定“同进同退”，选择相应的SNP类型，绝不会作 “叛徒”。用遗传学的术语来说，这几百个杂合遗传位点“高度连锁”，属于一个 “单体型”（haplotype）。
于是，郭龙华与 Alejandro Sánchez Alvarado 基于生殖细胞测序的结果提出了一种解释杂合遗传现象的假说：他们将这些杂合遗传的位点根据SNP分别定义为 “J型” 和 “V型”。在交配过后，只有单体型不同的精卵细胞之间才能正常地完成受精过程，形成 “J/V” 的受精卵。
随后，郭龙华发现自己从实验室的 “祖传小盒子” 中分离出的众多涡虫克隆系中，可以进行杂交的品系基因型全部为 “J/V”。而其中一个名为 “D5” 的克隆系内部虽然踊跃交配，产下比其他克隆系更多的卵囊，但这些卵囊中却孵化不出一只子代涡虫。而如果将 “D5” 克隆系与S2克隆系的涡虫进行交配，却能产生正常数量的子代涡虫。这一现象曾令郭龙华感到十分困惑——随着 “J/V” 单体型模型的提出，郭龙华发现，D5克隆系中这些杂合遗传位点原来高度纯合，具有 “J/J” 的基因型，这为郭龙华解释杂合遗传的模型更增添了一分证据。
2016年夏天，郭龙华博士毕业。2016年12月5日，他关于地中海涡虫杂合遗传的研究发表于《自然-演化与生态》。[14]
关于性染色体形成的猜想
（2017.6-2022.6）
01
基于博士的研究结果，郭龙华非常好奇自己在地中海涡虫J/V单体型中所发现的众多SNP位点是否具有特定的生物学意义。2017年6月，郭龙华成为了加州大学洛杉矶分校人类遗传学系的一员（博后）。也就是在这时候，他准备继续完成博士期间的未竟事业。
吸取了当年探究杂合遗传位点的失败经验，郭龙华这次决定选取两种新的方案双管齐下。
方案一是在将地中海涡虫尾部的Neoblast进行细胞周期同步化后，直接在显微镜下根据形态的不同将四对同源染色体分别解剖出来，然后逐一进行测序。这种方法的优越之处在于，由于是从物理上将不同的染色体进行分离，因此完全不用担心发生把基因序列组装到错误染色体上的问题。
方案二则是借助Hi-C技术在提取DNA以前加入交联剂，在物理上距离较近的基因序列之间建立起共价键连接后再进行深度测序，因此能够从最终的测序结果中还原出不同基因片段在染色体上的相对位置。
2019年，方案一率先撞线。在看到实验结果的一刹那，郭龙华立刻恍然大悟：将近九成（87.7%）的杂合遗传SNP位点都集中在1号染色体上！当初模型中提出的 “J/V” 单体型实际上正是对应于1号染色体上的两个同源染色体——准确来讲，尽管形态上十分接近，但地中海涡虫的1号染色体其实已经初步具备了性染色体的雏形。
紧接着郭龙华就发现，在涡虫的1号染色体上，的确富集了许多已知与性腺发育相关的基因，这进一步印证了他的猜想。
同时，他通过RADseq技术测量了不同染色体上交换（互换）突变发生的频率，发现唯独1号染色体对于同源重组的发生有高度的抑制效果。
2020年11月，Hi-C实验结果正式出炉，郭龙华在两个星期内完成了数据的分析，第一次将481个基因组板块组装成了4个染色体！并且再次印证了染色体测序的实验结果！
2021年9月，郭龙华将这一发现投稿到《自然》杂志，经过几个月的修改，于2022年4月被正式接收。
02
作为人类，我们拥有X和Y两种性染色体。我们知道男孩是XY染色体组合，女孩是XX染色体组合。可是这两种性染色体为什么在尺寸、形态上差异如此之大？它们是如何产生的？虽有假说若干，但都难以直接验证。目前我们观测到的多数物种中的性染色体都已经完成了分化的过程，在基因的成分和染色体的结构上都已经产生了巨大的变化。人类对染色体研究的区区百年又如何和进化史的万年、甚至亿年相提并论？
地中海涡虫雌雄同体和尚未完全分化的染色体的特性，为这一难题提供了特有的机遇。我们不能穿越万年，但是万年来的演化结果却都在我们生存的自然界里，和我们处于同一时刻。
地中海涡虫1号染色体上富集了众多与性腺发育相关的基因，表现出单体型表达的特征，无法进行同源重组，并且在雌雄发育的调控上表现出了功能的差异性。这或许就是大自然在性染色体恢弘壮丽的演化旅程过程中为我们留下的一份珍贵的琥珀资料。透过有性涡虫，我们得以一窥性染色体演化的最早期的秘密。
如今，郭龙华已经开启了科学生涯的新阶段：即将在这个夏天建立自己的独立实验室，继续探索涡虫留给我们的众多谜题。他也终于可以回到本心之初，去询问涡虫衰老和再生的问题（https://guolabagingreg.com/）。这些基本的科学问题，可以帮助我们了解所有的物种，包括人类自己。
或许，我们对于人类自身的好奇和治疗疾病的努力，在此刻的自然界中都有其答案。
Nature论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04757-3
参考文献：
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