crispr-cas9实验流程（CRISPR-Cas9构建CAR-T细胞LONZA细胞核转染仪）
crispr-cas9实验流程（CRISPR-Cas9构建CAR-T细胞LONZA细胞核转染仪）LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，即原德国Amaxa 4D-Nucleofector核转系统，结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过系统内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中，其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂，可加快基因表达，已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞，多数细胞系转染效率可高达50-70%，部分原代细胞转染效率可超过90%。目前，LONZA 4D-Nucleofector已大量应用于CAR-T细胞的研究中。4D-Nucleofector 核转仪及试剂盒3、体外扩增：进行CAR-T细胞的体外培养，使CAR-T细胞大量扩增至上百亿个；4、回输治疗：分多次将CAR-T细胞回输至患者体
CAR-T，即Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法），并不是一个新鲜事物，在上世纪90年代就已出现，但近年几经改良的CAR-T技术，作为细胞疗法已成功应用于部分血液癌的治疗中。2017年，诺华公司用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）的Kymriah、吉利德公司用于治疗特定类型非霍奇金淋巴瘤的Yescarta，成为第一批获得美国FDA批准上市的CAR-T药物，具有划时代的意义，同时也催生了全球CAR-T临床药物的研发热情。截止至2018年底，全球有超过680项CAR-T项目进入临床试验阶段，较2016年底增长超过200%，其中尤其以中美居多。
CAR-T技术涉及到采集患者的免疫细胞、体外细胞培养、转染、扩增和回输等细胞制备和治疗过程。
1、分离T细胞：从癌症病人血液中分离T细胞；
2、基因改造：通过基因转染，使T细胞表达能识别肿瘤特异性抗原并激活T细胞增殖的嵌合抗原受体CAR，即Chimeric antigen receptor；
3、体外扩增：进行CAR-T细胞的体外培养，使CAR-T细胞大量扩增至上百亿个；
4、回输治疗：分多次将CAR-T细胞回输至患者体内，识别并杀死肿瘤细胞。
目前采用慢病毒介导CAR基因转染T细胞的方法，慢病毒包装过程繁琐、周期长。同时，来源于人类免疫缺陷I型病毒（HIV 1）的慢病毒用于临床人体应用，其安全性始终存疑，饱受争议。
4D-Nucleofector 核转仪及试剂盒
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，即原德国Amaxa 4D-Nucleofector核转系统，结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过系统内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中，其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂，可加快基因表达，已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞，多数细胞系转染效率可高达50-70%，部分原代细胞转染效率可超过90%。目前，LONZA 4D-Nucleofector已大量应用于CAR-T细胞的研究中。
4D-Nucleofector细胞核转染系统操作示意图
用GFP标记的质粒转染新生儿皮肤成纤维细胞（NHDF-neo），2小时后用3.5% PFA 固定，共聚焦显微镜可观察到GFP蛋白在细胞核内表达。
Nucleofector转染NHDF-neo细胞
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，配备多种转染模块，可满足不同细胞类型、不同数量、不同通量的转染实验需求；
Nucleofector细胞核
电转过程中配合使用不同细胞类型专用转染试剂，转染效率远高于传统电转仪；
Nucleofector核转染试剂盒
采用由新型高分子聚合物制造的电极，相比传统铝制电转杯，杜绝金属离子毒害，细胞转染后成活率更高。
为提高细胞核转染效率，优化转染条件必不可少，相比其他品牌，LONZA可提供全球共享的数据库，可检索到700种以上的细胞转染数据和操作手册，除转染操作指导外，还提供细胞来源、传代、生长条件、培养基、转染后细胞培养基等各类技巧，大大节省摸索时间和试剂耗材损耗。
4D-Nucleofector细胞核转染平台，在小体积转染条件优化成功后，可不改变转染条件，直接用于大体积转染中，一次获得最多1*10^9数量的细胞，大大缩短实验时间。
LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，由1个主机加不同模块构成，各模块可单独配置：
1、C模块（必选）：细胞核转染系统主机，即核心模块（Core unit），内置各类细胞转染程序。
2、X模块（可选）：最常选择的小体积转染模块，用于各类悬浮细胞转染。允许使用2个电极杯和1个中通量16孔电极板条。其中电极杯为100uL体系，适用于2*10^5至2*10^7数量细胞；16孔电极板条各孔为20uL体系，适用于2*10^4至1*10^6数量细胞，可同时转染16个样品。
组合：C模块 X模块
3、Y模块（可选）：用于各类贴壁细胞的原位转染，无需消化细胞。允许使用1个24孔电极板，各孔为350uL体系，可同时转染24个样品。
组合：C模块 Y模块
4、LV模块（可选）：用于一种细胞的大规模连续转染。允许使用电转盘，其中小体积电转盘允许手动注射填充1mL，适用于1*10^7至1*10^8数量细胞；更大体积的电转盘允许以1mL体积不断进样，配合储液罐或储液袋，连续处理20mL体积，最高可转染10^9数量细胞。
组合：C模块 LV模块
5、96孔模块（可选）：用于高通量细胞转染，需要同时配置X模块。允许使用1个可拆卸的96孔电极板，由6个16孔电极板条组成，适用于2*10^4至1*10^6数量细胞，可同时转染96个样品，经常用于摸索转染条件。
组合：C模块 X模块 96孔模块
相关文献
Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.(Nature 2019 10(1):212)
Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.(Curr Protoc Immunol 2019 124(1):e69)
CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4 T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.(Nat Protocols 2019 14(1):1-27)
Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.(J Med Genetics 2019 56:10-17)
Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells.(Nat Methods 2018 15(11))
Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.(Hum Gene Ther 2018)
Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.(J Exp Med 2018 215(3):985-997)
CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells.(Frontiers in Immunology 2017 1:1-9)
CRISPR/Cas9-mediated PD-1 disruption enhances anti-tumor efficacy of human chimeric antigen receptor T cells.(Scientific Reports 2017 7(1):737)
