路易酶发展趋势（Chemistry利用逐步进化和结构引导共识工程定制醛酮还原酶KmAKR以获得良好的热稳定性和催化效率）

路易酶发展趋势（Chemistry利用逐步进化和结构引导共识工程定制醛酮还原酶KmAKR以获得良好的热稳定性和催化效率）图1分子对接热点筛选。为了提高KmAKRM5对（5R）-1的活性，通过使用来自假丝酵母的还原酶C1的（PDB ID:3WG6）结构作为模板构建KmAKRM5的同源性建模结构，与之具有最高同源性49%。如图1A和图2所示，KmAKRM5具有典型的（α/β）8桶结构（TIM结构）和催化四分体（D59-Y64-K89-H122）。此外，（5R）-1对接到KmAKRM5的同源模拟结构中，以探测影响活性的关键残基。（5R）-1的羰基氧原子与Y64-OH的H原子之间的距离为2.545Å，而（5R）-1的羰基碳与NADPH之间的距离为2.771Å，这表明KmAKRM5/（5R）-1的对接结构是合理的。作者发现围绕底物结合袋的残基A30和T302影响酶和底物之间的相互作用，从而影响KmAKRM5的活性（图1B）。除了活性和选择性之外，热稳定性也是酮还原酶工业应用的障碍。此外，众所周知，提高反应温度会增加反

今天推送的文章是发表在Bioorganic Chemistry上的“Tailoring an aldo-keto reductase KmAKR for robust thermostability and

catalytic efficiency by stepwise evolution and structure-guided

consensus engineering”，通讯作者是来自浙江工业大学生物工程学院的王亚军教授。

酮还原酶已被证明是不对称氢化反应中有价值的生物催化剂，可将醛或酮转化为相应的手性醇。短链脱氢酶/还原酶（SDR）、中链脱氢酶/还原酶（MDR）和醛酮还原酶（AKR）是三个重要的酮还原酶超家族。其中，AKR由190多个成员组成，广泛分布于哺乳动物、植物、微生物等。结构分析表明，AKR具有保守的催化残基D-Y-K-H和典型的（α/β）₈桶。近年来，微生物AKR在手性醇生物合成中的潜力得到了广泛的研究，并且越来越多的AKR被发现。然而，迄今为止，适合于工业应用的AKR或其他具有优异催化性能的酮还原酶的数量仍然有限。

除了活性和选择性之外，热稳定性也是酮还原酶工业应用的障碍。此外，众所周知，提高反应温度会增加反应速率，降低介质粘度，从而促进传质。AKR有一个不同的结构，缺少一个类似Rossmann褶皱的结构域，这在SDR和MDR中是典型的，通常作为一个单一的结构域存在。此外，关于AKRs热稳定性机理的研究也很少。尽管定向进化、半理性设计和理性设计已成功应用于热稳定性增强，但稳定性和活性之间的权衡仍然是一个挑战。因此，迫切需要在不影响AKR活性或选择性的情况下改善热稳定性的策略。

在作者前期工作中，从耐高温酵母Kluyveromyces marxianus ZJB14056中克隆了一个醛酮还原酶(KmAKR)，并培育出一系列活性和热稳定性增强的KmAKR突变体。通过位点饱和突变(SSM)、迭代饱和突变(ISM)和丙氨酸扫描等方法构建了突变株KmAKR_M5(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M)。尽管KmAKR_M5的催化活性k_cat/K_m(210.77 vs 1.35s⁻¹mM⁻¹)提高了155倍，但在40℃(695min vs 846min)下的半衰期(t_1/2)仅比WT KmAKR提高了22%，因此它的热稳定性仍有很大的提高空间。

在此，通过逐步进化，KmAKR_M5的热稳定性和催化效率同时得到提高。首先，通过位点饱和突变（SSM）和高通量筛选（HTS），作者发现热点残基通过增加KmAKR和6-氰基-(5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯((5R)-1)之间的结合亲和力进一步提高催化效率。然后，作者通过使用一种新的共识策略结合结构分析，确定了在不牺牲活性的情况下负责热稳定性增强的关键残基，产生了“最佳”突变KmAKR_M9。最后，对KmAKR_M9催化合成手性二醇叔丁基-6-氰基-(3R，5R)-二羟基己酸酯((3R，5R)-2)的工艺进行了评价，以考察其工业潜力。

分子对接热点筛选。为了提高KmAKR_M5对（5R）-1的活性，通过使用来自假丝酵母的还原酶C1的（PDB ID:3WG6）结构作为模板构建KmAKR_M5的同源性建模结构，与之具有最高同源性49%。如图1A和图2所示，KmAKR_M5具有典型的（α/β）₈桶结构（TIM结构）和催化四分体（D59-Y64-K89-H122）。此外，（5R）-1对接到KmAKR_M5的同源模拟结构中，以探测影响活性的关键残基。（5R）-1的羰基氧原子与Y64-OH的H原子之间的距离为2.545Å，而（5R）-1的羰基碳与NADPH之间的距离为2.771Å，这表明KmAKR_M5/（5R）-1的对接结构是合理的。作者发现围绕底物结合袋的残基A30和T302影响酶和底物之间的相互作用，从而影响KmAKR_M5的活性（图1B）。

图1

随后，利用SSM和HTS方法分析了残基A30和T302的作用。在第30位进行一轮SSM后，对从96孔板中筛选出的活性较高的阳性转化子进行高效液相色谱(HPLC)分析。结果表明，阳性突变体KmAKR_M6(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P)的相对活性比KmAKR_M5高28.6%。此外，位于结合位点Y301附近的残基T302可增强(5R)-1结合亲和力。因此，使用KmAKR_M6作为模板在位置302进行第二轮SSM。结果表明，阳性突变体KmAKR_M7(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T320S)的相对活性比KmAKR_M5高52.2%。与KmAKR_M5相比，KmAKR_M6、KmAKR_M7对(5R)-1的底物亲和力(K_m)分别降低了18.6%、32.5%，催化常数(k_cat)分别降低了6.3%、14.9%，k_cat/K_m分别提高了15.2%、26.2%。

热稳定性关键残基的鉴定。为了在不牺牲活性的情况下构建具有较高热稳定性的突变体，采用了共识策略和结构分析相结合的策略。采用共识策略设计了S10N、T42V、I44Q、S48A、E76I、F90Y、N109K、L130K、N131G、T136E、L141M、A168K、S196C、L245R共14个突变。结构分析排除了位于活性位点12Å内的突变，分别为T42V、I44Q、S48A、F90Y、T136E、L130K、L141M。根据SAS≥为30%的非共识残基突变为亲水性共识残基，将SAS<30%的非共识残基替换为疏水性共识残基，通过定点突变(SDM)引入了S10N、N109K、A168K、S196C四个突变(图2)。这与发现嗜热酶具有更亲水的外表和更疏水的内部是一致的。相应地，突变S196C和N109K使KmAKR_M5的T₅₀¹⁵值分别提高了4.6℃和1.7℃。出乎意料的是，突变S10N和A168K使T₅₀¹⁵分别降低了0.8℃和3.0℃。

图2

随着阳性突变体的活性和热稳定性的提高，作者从KmAKR_M5开始逐步组合A30P、T302S、N109K和S196C突变株，产生了4个组合突变体KmAKR_M6(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P) KmAKR_M7(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T320S) KmAKR_M8(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K) KmAKR_M9(W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C)。结果表明，突变株M6-M9的相对活力分别比KmAKR_M5高28.6%、52.2%、86.7%和79.7%(表1)。虽然KmAKR_M9的k_cat下降了16.7%，但KmAKR_M9的K_m下降了38.2%，导致k_cat/K_m比KmAKR_M5增加了34.7%(表2)。此外，在KmAKR_M9转向NADPH的情况下，k_cat增加27.4%，K_m减少9.1%，k_cat/k_m提高了40.1%(表S3)。结果表明，活性中心内适当的构象柔性对活性很重要。这说明可以通过加强KmAKR_M5与(5R)-1之间的相互作用来进一步提高催化效率。

T302S的突变同时提高了热稳定性和活性(表1，图3A)。但当进一步引入突变N109K时，突变株KmAKR_M8对热稳定性没有影响，但其相对活性比KmAKR_M7提高了35%。突变体KmAKR_M5、KmAKR_M8和KmAKR_M9在40℃的半衰期(t_1/2)分别为846、2016和2436min，在50℃时的半衰期(t_1/2)分别为126min、474min和972min。显然，KmAKR_M9在40和50℃时的t_1/2分别增加了1.9倍和6.7倍(表3)。为了进一步研究联合突变对KmAKR_M5热力学稳定性的影响，用圆二色谱(CD)测定了KmAKR_M8、KmAKR_M9的T_m值。KmAKR_M8、KmAKR_M9的T_m值分别比KmAKR_M5高1.5℃和8.2℃(图3B)。

图3

活性和热稳定性增强机理的阐明。为了研究KmAKR_M5-M9活性增强的分子机制，作者以3WG6为模板，与(5R)-1对接，构建了KmAKR_M5-M9的三维结构。注意到A30位于α1/α2之间的环上，当A30被Pro取代时，对接结构显示(5R)-1的羰基氧与T25的侧链(2.2Å)之间形成了额外的氢键。A28、V298和(5R)-1之间较强的疏水相互作用是K_m值降低和k_cat/K_m增加的原因(图4A，4B)。此外，T302位于C端的环上的一个β转弯上，靠近底物结合位点298和302。用丝氨酸取代T302后，Y64、Y301、H122和(5R)-1残基之间的氢键均由2.7、2.7和2.2 Å缩短到2.4、2.6和2.0 Å，增强了酶-底物结合亲和力，提高了KmAKR_M6的k_cat/k_m(图4C)。此外，另一个热点残基N109是活性中心外的表面残基(>12Å)，位于螺旋α5上。虽然突变N109K与(5R)-1没有直接相互作用，但它在残基T25和(5R)-1之间引入了两个额外的氢键，与KmAKR_M7(图4D)相比，它具有更强的结合亲和力和更高的催化效率。突变S196C没有改变KmAKR_M8的活性。

图4

有趣的是，T302S还使KmAKR_M6的T₅₀¹⁵值提高了1.6℃，这与S302和H296之间形成的新的氢键有关，该氢键提高了C末端区域表面环的稳定性(图5A，5B)。氢键在稳定蛋白质二级结构中通常起着重要的作用。稳定高柔性环是提高酶热稳定性的有效方法。另一个热点残基 N109 是表面残基，位于活性位点之外 (>12 Å)。当该残基被 Lys 取代时，KmAKR_M5的热稳定性增强。当突变 N109K 与突变 A30P 和 T302S 组合时，观察到额外的氢键G122-K109和电荷-电荷相互作用E105-K109（图5C，5D），然而，突变N109K和T302S对热稳定性没有额外影响。此外，与 KmAKR_M5相比，使T₅₀¹⁵增加4.7℃的关键残基S196也在活性位点之外（>12 Å），位于螺旋α9上并埋在蛋白质内部。用Cys取代S196导致C196和内部残基N177之间形成一个额外的氢键，并且Cys196 和内部残基L163、I192和I201之间的疏水相互作用增加，这增加了蛋白质的内力，因此显着改善热稳定性（图5E，5F）。这些结果与疏水相互作用决定了大约 60% 的蛋白质稳定性的理论是一致的，这比其他因素对蛋白质的热稳定性的贡献更大。此外，通过增加疏水相互作用来提高热稳定性。得出的结论是，柔性环的刚性化和通过引入额外的氢键和增加疏水相互作用来增强内力提高了KmAKR_M5的热稳定性。

图5

为了进一步研究热稳定突变对结构稳定性的影响，在25、50和55℃下进行了MD模拟。KmAKR_M5和 KmAKR_M9的结构在25℃的20 ns 模拟期间保持稳定（图6A）。在50℃时，KmAKR_M9在20 ns 模拟期间仍然保持稳定，而KmAKR_M5在10 ns 后开始失去其结构稳定性（图6B）。在55°C时，KmAKR_M5严重失去其结构稳定性，而KmAKR_M9仍保持稳定，这与T_m变化一致，表明 KmAKR_M9比KmAKR_M5具有更高的热稳定性。如图6D所示，KmAKR_M9的残基D162-Q221的均方根波动(RMSF)值低于KmAKR_M5，这归因于残基L163、C196、I192和I201之间的额外疏水相互作用，而残基R294-位于C末端环上的E312也显示出低得多的RMSF值，这可能是由于新的氢键T302-H296。

图6

在本工作中，KmAKR_M5的热稳定性和活性同时通过逐步进化得到提高。在与(5R)-1结合的残基附近的两个位置进行了两轮SSM。“最佳”突变体KmAKR_M9在50℃时t_1/2增加6.7倍，在40℃时相对活性提高79.7%，催化效率提高34.7%。当S/C比为50g g⁻¹时，在350g L⁻¹浓度下，KmAKR_M9在3.7h内即可完全还原(5R)-1，最高可达1.82kgL⁻¹d⁻¹，是现有文献中最高的水平，在此条件下，KmAKR_M9在350g L⁻¹浓度下仅用3.7h即可完全还原(5R)-1，最高可达1.82kgL⁻¹d⁻¹。因此，KmAKR_M9是合成(3R，5R)-2的强效生物催化剂。

整理：李岚雪

文章信息：

PMID: 33735657

DOI：10.1016/j.bioorg.2021.104712