当不同室友发现蟑螂：华师研究蟑螂 谈恋爱

当不同室友发现蟑螂：华师研究蟑螂 谈恋爱合作单位：华南师范大学生命科学学院昆虫科学和技术研究所DOI ：10.1038/s41559-022-01808-w期刊：Nature ecology & evolution日期：2022-07-04IF ：19.1

蟑螂也会展翅求偶？人人避之不及的“小强”也会“谈恋爱”！关关雎鸠，在河之洲；窈窕淑女，君子好逑，像《诗经》所描述的一样，那是因为性信号唤起了性吸引力。

2022年7月4日，百迈客合作单位—华南师范大学李胜教授团队在国际权威期刊Nature Ecology & Evolution（IF=19.1）在线发表了题为“A single gene integrates sex and hormone regulators into sexual attractiveness”（单基因整合性别和激素调控因子来决定性吸引力）的研究论文，鉴定出近30年未知的控制德国小蠊接触性信息素（Contact sex pheromone）合成的最关键基因，并在此基础上揭示蟑螂性别和年龄特异的性吸引力产生的分子机制。

英文标题：A single gene integrates sex and hormone regulators into sexual attractiveness.

中文标题：单基因整合性别和激素调控因子来决定性吸引力

期刊：Nature ecology & evolution

日期：2022-07-04

IF ：19.1

DOI ：10.1038/s41559-022-01808-w

合作单位：华南师范大学生命科学学院昆虫科学和技术研究所

研究背景

德国小蠊（Blattella germanica）作为最常见的世界性家居害虫，尤其在华南地区为害严重，其繁殖力惊人、种群增长快。德国小蠊营严格的两性生殖，性成熟的雌虫合成接触性信息素（Contact sex pheromone）刺激雄虫求偶并诱导两性交配。因此，德国小蠊是一种在化学性信息素和性行为方面都有全面研究的物种，是研究两性相互性信号传递的极好昆虫模型。尽管其性信息素已得到系统鉴定，但控制该合成途径的关键基因仍不清楚。此外，为什么仅有雌虫合成性信息素，而且性成熟的雌虫具有更强的性吸引力？性信息素合成受何种上游信号途径的调控？这些问题没有明确答案。

该研究综合利用行为学、生物化学、分子、遗传和生物信息等分析手段，鉴定出其接触性信息素生物合成途径最为关键的限速酶基因CYP4PC1，并在此基础上系统揭示了性别和年龄特异的性吸引力产生的分子机制，为理解动物性信号的产生和复杂调控提供新的见解。

实验材料与方法

实验动物：德国小蠊，被保存在27°C的塑料罐中，相对湿度为70%，光照周期为12:12小时，以商业鼠食和自来水喂养。在24小时内收集并培养新孵化的若虫，刚出笼的若虫和成虫在蜕皮当天（第0天）按性别从群体中分离出来，并分组饲养。

转录组：成年蟑螂身上解剖触角和腹部表皮，采用Illumina测序平台进行转录组测序。

实验方法：RACE、qPCR、RNAi干扰、JH处理、遗传相互作用实验、western blotting、双荧光素酶分析、DNA蛋白结合实验、求偶行为实验等。

结果

• 参与CSP生物合成的细胞色素P450（CYP）候选基因筛选

在进行CYP候选基因筛选之前，作者分析了两种表皮CSP成分：C29和C27甲基酮在雄虫雌虫组织和年龄中的变化。研究发现在成年雄虫中未检测到这两种甲基酮，但在第一个卵黄形成周期中，它们在雌虫中持续增加（图1a）。C29甲基酮分布在整个雌虫体表，并且在触角和翅膀上的浓度明显高于其他身体部位（图1b），表明触角和翅膀可能是CSP产生或积累的主要部位。

为了筛选编码限速羟化酶的性别和年龄特异性CYP基因，作者对不同年龄的雌虫触角进行了比较转录组分析，使用雄虫触角作为阴性对照。与雄虫相比，23个CYP基因在性成熟（第7天）雌虫中表现出显著上调，其中C0J52_06753（之前通过基因组注释命名为CYP4C1_9）在雌虫触角中的表达在第一个卵黄形成周期期间持续增加（图1c），类似于表皮CSP合成的发展模式。从腹部表皮的RNA序列中也获得了类似的结果（图1d）。C0J52_06753命名为CYP4PC1（GenBank no.MZ962381），为一个新的4PC亚家族。通过qPCR和蛋白质印迹验证CYP4PC1的时空表达模式，结果显示与CSP合成相同，CYP4PC1信mRNA和蛋白质均显示出显著的雌虫特异性（图1e），并在触角和翅膀中显著富集（图1f，图2g）。相比之下，非性别特异性CYP4G19，在腹部表皮中丰富表达，但在雄虫雌虫的触角和翅膀中均未检测到（图1f）。这些结果表明CYP4PC1是调控CSP合成的关键候选基因，可能与羟基化步骤有关。

CSP生物合成候选CYP基因筛选

• CYP4PC1是CSP合成和雌虫吸引力所必需的基因

从雌虫六龄若虫（N6）开始，通过多次注射CYP4PC1双链RNA（dsCYP4PCl）进行了RNA干扰（RNAi）实验，成功干扰了CYP4PC1基因表达，导致C29甲基酮表达显著减少和C27甲基酮的可检测水平不足（图2b）。相比之下，CYP4PC1敲除对角质层碳氢化合物表达没有影响，包括作为甲基酮CSP组分直接前体的两种3 11-二甲基烷烃（图2c）。然后，使用WT雄虫进行行为分析，对注射dsRNA的雌虫作出回应。高比例的WT雄虫（93.4%）对dsMuslta雌虫（RNAi对照）升起翅膀表现出求偶行为，但只有23.2%对dsCYP4PC1雌虫有反应。值得注意的是，92.5%对dsCYP4PC1雌虫无求偶行为的雄虫对dsMuslta雌虫进行了展翅（图2d）。

这些行为数据表明，CYP4PC1不仅是甲基酮合成所必需的，而且也是合成甲基酮衍生的醇和醛成分所需要的，因为每个CSP成分都可以独立地引发雄虫的展翅求偶。这些结果表明，CYP4PC1是合成刺激雄虫向雌虫求爱的CSP所必要的基因，最有可能参与CSP组分碳氢化合物前体的羟基化过程。

CYP4PC1控制雌虫CSP的产生和性吸引力

• JH促进CYP4PC1表达以维持雌虫吸引力

保幼激素（JH）在雌虫体内循环产生，且JH含量度高于雄虫。JH还调节和协调卵巢的生殖成熟，以及性信息素的产生。在JH结合时，JH受体耐甲氧脯氨酸（Met）和辅激活剂（Tai）诱导JH主要应答基因的表达，即Krüppel同源物1（Kr-h1）。在整个N6和成年期，CYP4PC1表现出类似于Kr-h1的表达模式，表现为性二型，证实了CYP4PC1是CSP生物合成途径中JH激发的CYP基因。对成年雌虫用JH III（蟑螂体内的天然JH）处理，导致CYP4PC1的mRNA和蛋白质表达水平显著上调，但CYP4G19的mRNA和蛋白质表达水平没有显著上调（图3a、b）。相比之下，Met或Kr-h1敲除对CYP4PC1有相反的影响，而CYP4G19没有受到影响（图3c、d）。此外，Kr-h1基因敲除导致C29甲酮表达减少，从而导致雄虫升翅膀的潜伏期增加，这两种情况都通过外源性JH III处理得以恢复（图3e）。

成年WT雄虫蟑螂JH III处理发现，27.5%的成年雄虫展开翅膀，而这一行为通常通过与雌虫的触角接触刺激（图3f、g）产生。同样，外源JH III处理促进了成年雄虫中CYP4PC1的表达和C29甲基酮的产生（图3g）。此外，CYP4PC1敲除限制了JH III诱导的CYP4PC1表达、C29甲基酮产生和成年雄虫中的同性恋求爱（图3g）。雌虫的功能丧失研究和雄虫的功能获得研究都表明，JH诱导的CYP4PC1表达维持了CSP的合成，从而保持了性吸引力。

激素调节的CYP4PC1表达维持雌虫吸引力

• 性别分化基因控制性二型CYP4PC1的表达

性吸引力发展的一个长期存在的问题是，为什么性信息素是以性二态性的方式产生的。因此，作者研究了雌虫特异性CYP4PC1表达是否受性别分化基因控制。在德国小蠊中，有两种雌虫特异性双性亚型（dsxF；dsx2和3）和一种雄虫特异性dsx亚型（dsxM；dsx1）。将针对所有亚型的dsDsx注射到成年雌虫中仅干扰了触角中dsx2的表达，而dsx3的表达没有改变，导致CYP4PC1 mRNA表达轻微降低，但其蛋白水平没有变化（图4a）。与先前的研究一致，雌虫中tra基因的RNAi阻止了dsxF（dsx2和3）的形成，并促进了dsxM的转录。Tra敲除使雌虫触角中CYP4PC1表达减少了80%以上，这比单独敲除dsxF强得多。dsTra抑制了CYP4PC1 mRNA和蛋白质水平，但可通过同时注射dsTra和dsDsx显著恢复（图4a），表明dsDsx消除了dsTra诱导的dsxM对CYP4PCl表达的抑制。此外，tra基因敲除降低了C29甲基酮的合成，因此延长了雄翅上升的潜伏期，tra和dsx的同时敲除拯救了这两种情况（图4b）。为了了解dsxF和dsxM是否以不同方式调节CYP4PC1表达，作者在成年雄虫中进行了dsxM的RNAi实验。大多数注射了dsDsx的雄虫通过抬升翅膀相互求爱，以雌二醇分泌物为食，甚至试图与其他雄虫交配，而同时注射dsDsx和dsCYP4PC1的雄虫完全没有这些雄虫-雄虫性吸引力的行为特征（图4c）。同时，dsxM敲除可显著提高CYP4PC1 mRNA和蛋白质表达水平、C29甲基酮的产量和WT雄虫的性吸引力，所有这些都可通过CYP4PCl敲除恢复到低水平（图4d-f）。这些功能研究表明，性别分化基因在调节性二态基因CYP4PC1表达和CSP合成中起着关键作用。

此外，RNAi干扰fru基因（另一个受tra控制的性别分化基因）并没有改变成年雄虫中dsxM和CYP4PC1的表达。结合以上这些两性的功能研究，猜测dsxM应该是控制性别特异性CYP4PC1基因表达的主要抑制因子。在CYP4PC1的5′端启动子序列中，存在一个预测的dsx和mab-3相关转录因子结合位点（DBS），位于核苷酸−99至−87位置。果蝇Kc细胞中dsxM的过表达显著降低了由含有DBS的175bp CYP4PC1启动子片段驱动的荧光素酶活性（图4g）。总的来说，DsxM与CYP4PC1启动子中的DBS结合，从而切断雄虫中CYP4PC1的表达，这阻止了雌虫CSP的合成，并避免了雄虫之间的性吸引。

性别分化基因控制性二型CYP4PC1的表达

• 性别分化和JH信号协调调节CSP的生物合成

迄今为止，尚不清楚性别分化和JH信号通路是否能够以及如何协调控制昆虫的任何性信号。在蟑螂中，JH III生物合成的最后两个步骤由两种关键酶催化，即阿拉塔体中的JH酸甲基转移酶（Jhamt）和法呢糖酸甲酯环氧化酶（CYP15A1），导致雌虫偏向JH III的产生。tra或dsxF的敲除导致Jhamt和CYP15A1表达降低，tra敲除也下调了触角中Kr-h1的表达（图5a）。这些数据表明，性别分化基因调节成年雌虫JH生物合成基因的表达，从而调节JH信号。JH信号的抑制降低了dsxF的表达，但没有降低tra的表达（图5b）。性别分化和JH信号通路之间的相互干扰表明，在雌虫中CYP4PC1表达在这两条通路相互放大。由于tra敲除影响JH生物合成，同时通过外源性JH III或Kr-h1的敲除来改变JH信号。JH III处理显著提高了CYP4PC1蛋白表达水平，而被dsTra处理降低的CYP4PC1表达量，在JH III处理后部分恢复（图5c）。与单独的tra或Kr-h1的敲除相比，tra和Kr-H2的同时缺失更大的下调了CYP4PC1表达水平和C29甲基酮产量（图5d）。这些实验数据证实，性别分化和JH信号协调调节CYP4PC1指定的CSP产生。

为了解决为什么蟑螂雄虫不合成雌虫CSP的问题，作者还研究了性别分化和JH信号通路对成年雄虫雌虫CSP生成的相互作用。dsxM敲除只略微上调了Jhamt，但没有上调CYP15A1和Kr-h1，而JH III处理只略微诱导了dsxM表达（图5e）。同时进行dsxM敲除和JH III处理对CYP4PC1表达和C29甲酮合成的刺激作用要比单独处理大得多（图5f）。遗传相互作用实验表明，DsxM结合启动子直接抑制CYP4PC1表达，JH信号的缺乏都是成年雄虫中CYP4PC1表达和CSP合成缺失的原因，提高CYP4PC表达水平能够引起雄虫的性吸引力和求偶行为。

性别分化和激素信号调节CYP4PC1特异性性吸引力

• CYP4PC1以剂量依赖的方式控制配偶选择

这些行为分析表明，CYP4PC1通过促进女性特异性CSP的合成，定量控制了性识别和吸引力。为了了解CYP4PC1如何影响配偶选择，作者进行了竞争性求偶试验，评估了单个WT雄虫的求偶行为来回应两种具有不同的CYP4PC1表达和CSP产生的相互竞争的蟑螂（雌虫和/或雄虫）。作者用一个求偶指数来量化了雄虫的求偶反应，求偶指数来源于对翅膀升起的持续时间和对CSP高度敏感度。一系列竞争性分析表明，N6龄雌虫对WT雄虫的吸引力最低，其次是从第1天起，成年雌虫的吸引力增加。dsDsx处理第5天的雄虫和用dsTra和dsKr-h1处理第五天的雌虫对WT雄虫具有相似的吸引力，其次是第5天雌虫；用dsDsx和外源性JH III处理的第5天雄虫最具吸引力（图6a）.

此外，CYP4PC1表达与CSP合成之间以及CSP合成与雄虫求偶指数之间的正相关分析表明，CYP4CC1表达越高，CSP含量越高，因此对WT雄虫的性吸引力越大（图6b）。总之，WT雄虫更喜欢以剂量依赖性的方式追求CYP4PC1表达和CSP合成较高的蟑螂，而不考虑产生CSP的蟑螂的性别。通过相互影响和共同作用，性别分化和JH信号协调编码特异性CYP4PC1的雌虫性吸引力（图6c）。

CYP4PC1以剂量依赖的方式控制配偶选择

文章亮点总结

该项研究利用转录组分析预测和基因敲降技术，结合生化测定和行为学分析，发现CYP4PC1是德国小蠊合成接触性信息素合成最为关键的酶基因。CYP4PC1表达量在雌虫性成熟过程持续升高，与CSP含量变化高度一致，受昆虫保幼激素（JH）经典核信号JH-Met-Kr-h1途径促进表达，从而保证性成熟的雌虫具有更高的CSP含量和性吸引力。雄虫血淋巴JH含量相对较低，这可能是雄虫不合成CSP的原因之一。研究发现，外源JH处理雄成虫可使其合成一定量的CSP，获得了类似雌虫的性吸引力，诱导野生型雄虫向其举翅求偶。CSP的合成和CYP4PC1表达均表现为典型的雌虫特异性。性别分化信号途径调控CYP4PC1在雌虫特异表达，双性基因doublesex (dsx)雄虫特异的转录产物DsxM（DMRT转录因子）可与CYP4PC1启动子结合从而抑制其在雄虫表达。在雄成虫中敲降dsxM可导致典型的同性恋行为，且该行为可被CYP4PC1敲降所挽救。

随后通过遗传互作实验表明，性别分化和JH信号途径可以在雌虫中相互影响和协作，使CSP的合成受到精密的调控。通过一系列竞争求偶行为学分析，还证明了CYP4PC1以剂量依赖性方式控制CSP合成并调控雄虫求偶指数。在此基础上提出性吸引力分子调控的理论体系：“刹车-油门”理论模型。研究结果不仅为干扰求偶交配行为的害虫治理策略提供潜在的分子靶标，而且为理解动物性信号的产生和复杂调控提供新见解。