转基因食品过敏性检测方法：动物源性食品中细菌的检测
转基因食品过敏性检测方法：动物源性食品中细菌的检测3 流行病学特征吞服10万个以上活菌即可发病，个别可呈败血症表现。该菌有侵袭作用，其产生的TDH和相对耐热直接溶血素（TRH）的抗原性和免疫性相似，皆有溶血活性和肠毒素作用，可引致肠袢肿胀、充血和肠液潴留，引起腹泻。TDH对心脏有特异毒性，可引起心房纤维性颤动、期前收缩或心肌损害。该菌具有O、H及K抗原。O抗原分12个型，K抗原约有59个型。2 致病性该菌的致病株绝大多数能裂解人、兔等红细胞，因此可用溶血反应区分致病株与非致病株，此称为神奈川试验。该菌具有溶血性归因于其能产生溶血毒素，该毒素名为耐热直接溶血素（TDH），属于穿孔毒素，为不含糖或脂的蛋白质，相对分子质量32000～44000，与霍乱弧菌非O1群及拟态弧菌产生的TDH大致相同。TDH家兔肠袢结扎试验阳性，但致病性不如霍乱肠毒素及大肠杆菌肠毒素。另外，在神奈川试验阴性的菌株中，还发现一种不耐热的毒素磷酸酯酶A2，也被认为是该菌的
副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及盐分含量较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。该菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，在海水中可存活47d。临床上以急性发病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌食物中毒多在夏秋季节发生于沿海地区，常造成集体发病。该病多发生在6—10月海产品大量上市时。中毒食品主要是海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后中毒。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染。
1 病原学特征
副溶血性弧菌系弧菌科、弧菌属，革兰氏染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌（图2-10），随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态，两极浓染。菌体一端有单根鞭毛，运动活泼。无芽孢、无荚膜。该菌营养要求不高，在普通培养基中加入适量氯化钠即能生长。氯化钠最适浓度为35g/L，在无盐培养基中不生长。在液体培养基表面形成菌膜。在35g/L氯化钠琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成1～2.5mm、稍隆起、浑浊、无黏性、绿色的菌落；在羊血琼脂平板上，形成2～3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色的菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血；在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。
该菌不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。生长所需pH为7.0～9.5，最适pH为7.7。最适宜的温度为30～37℃，该菌对酸较敏感，当pH在6以下时不能生长，在普通食醋中1～3min即死亡。利用甘露醇产酸，可使甘露醇盐培养基变为黄色。该菌的致病性与其溶血程度是平行的。赖氨酸脱羧酶阳性，精氨酸双水解酶阴性。嗜钠离子，可在含7.5%氯化钠的培养基上生长。在3%～3.5%盐水中繁殖迅速，每8～9min为一个生长周期，在低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。对热的抵抗力也较弱，50℃经20min、65℃经5min或80℃经1min即可被杀死。该菌对常用消毒剂抵抗力很弱，可被低浓度的酚和煤酚皂溶液杀灭。
该菌具有O、H及K抗原。O抗原分12个型，K抗原约有59个型。
2 致病性
该菌的致病株绝大多数能裂解人、兔等红细胞，因此可用溶血反应区分致病株与非致病株，此称为神奈川试验。该菌具有溶血性归因于其能产生溶血毒素，该毒素名为耐热直接溶血素（TDH），属于穿孔毒素，为不含糖或脂的蛋白质，相对分子质量32000～44000，与霍乱弧菌非O1群及拟态弧菌产生的TDH大致相同。TDH家兔肠袢结扎试验阳性，但致病性不如霍乱肠毒素及大肠杆菌肠毒素。另外，在神奈川试验阴性的菌株中，还发现一种不耐热的毒素磷酸酯酶A2，也被认为是该菌的毒力因子。
吞服10万个以上活菌即可发病，个别可呈败血症表现。该菌有侵袭作用，其产生的TDH和相对耐热直接溶血素（TRH）的抗原性和免疫性相似，皆有溶血活性和肠毒素作用，可引致肠袢肿胀、充血和肠液潴留，引起腹泻。TDH对心脏有特异毒性，可引起心房纤维性颤动、期前收缩或心肌损害。
3 流行病学特征
副溶血性弧菌的分布极广，副溶血性弧菌中毒发病期多在5—11月，以7—9月为高峰期。副溶血性弧菌中毒呈世界性分布，我国和日本发病率最高。由于气温能影响海产品及被污染食物的细菌繁殖，故在气温较高的沿海及海岛地区发病率较高，常呈暴发流行。各年龄均可发病，最幼为2个月大，最大的年龄为81岁，其中以青壮年居多。在我国近海的河中淡水鱼也有较高的带菌率。我国华东地区沿岸海水中的检出率为47.5%～66.5%，海产鱼虾的平均带菌率为45.6%～48.7%，夏季可高达90%以上。除了水产品以外，畜禽肉、咸菜、咸蛋等都被发现有副溶血性弧菌的存在。
副溶血性弧菌引起食物中毒的原因主要是：①食品加热不彻底未达到灭菌目的，生食海制品是最主要的传播途径；②制作不符合卫生要求，如熟食被接触过生海产品的刀、砧板、容器等污染；③熟食保管不善，一旦受到副溶血性弧菌污染，该菌增代时间仅10min，故易于大量繁殖，达到足以致病菌量。中毒一般表现为发病急，潜伏期2～24h，一般为10h发病。主要的症状为腹痛，脐部附近剧烈腹痛是该病的特点，多为阵发性绞痛，并有腹泻、恶心、呕吐、畏寒发热，粪便似水样。便中混有黏液或脓血，部分病人有里急后重表现，重症患者因脱水而皮肤干燥及血压下降而休克。少数病人可出现意识不清、痉挛、面色苍白或发绀等现象，若抢救不及时，呈虚脱状态，可导致死亡。近年来国内报道的副溶血性弧菌食物中毒临床表现不一，可呈典型、胃肠炎型、痢疾型、中毒性休克型或少见的慢性肠炎型。山区、内陆居民去沿海地区而感染者病情较重，临床表现典型；沿海地区发病者病情一般较轻。
4 危害
副溶血性弧菌食物中毒是由副溶血性弧菌所致。临床常急性发病，以腹痛、吐泻、发热等为特征。1950年10月从日本大阪市发生的一起咸沙丁鱼食物中毒的患者肠道排泄物和食物中首次分离出副溶血性弧菌。随后1955年在日本新潟因食用近海鱼类乌贼引起副溶血性弧菌食物中毒，有2万居民患病。在日本，副溶血性弧菌食物中毒占细菌性食物中毒的70%～80%。1958年上海市防疫站也从烤鸭所致食物中毒的患者中分离出该菌，以后日本、印度、美国等许多国家均陆续有报道。2004年苏州发生了近百人副溶血性弧菌食物中毒事件；2009年5月重庆某县发生副溶血性弧菌食物中毒事件，导致89人住院；2010年10月四川发生了396人副溶血性弧菌食物中毒事件；2011年9月广州发生了49人副溶血性弧菌食物中毒事件。
5 检测方法
5.1 分离鉴定
5.1.1 分离培养
称取样品25g，加225mL3.5%灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，分别接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板；同时取10mL加入100mL氯化钠结晶紫增菌液中，于37℃8～16h培养后，将培养物也接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，37℃培养18～24h取出观察，挑取可疑菌落，转接3.5%氯化钠三糖铁斜面，37℃培养24h观察结果。
5.1.2 涂片镜检
将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（分解葡萄糖，产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
5.1.3 嗜盐性试验
将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0%、3%、7%、10%），于37℃、24h培养后观察生长情况，在无盐和10%盐的胨水中不生长，在3%和7%盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
5.1.4 生化试验
分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、VP，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，于37℃培养，除VP、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5.1.5 动物试验
将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5%氯化钠胨水，经37℃、16～18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2～3d，将死亡小鼠进行解剖做分离培养。
5.2 分子生物学方法
5.2.1 DNA模板的制备
取以上增菌液1mL于小离心管中，4000～5000r/min离心5min，弃上清液，向菌沉淀中加入50μL灭菌纯水制成菌悬液，混匀后100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，取上清液作为PCR模板。
5.2.2 引物设计
上游引物为5′-AAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′；下游引物为5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′。扩增片段长度为450bp。
5.2.3 PCR反应体系
25μL反应体系：DNA模板2.0μL；PCR预混液12.5μL；引物10L；ddH2O9.5μL。
5.2.4 PCR反应参数
95℃预变性5min；95℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃后延伸5min。4℃保存。
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当调整。
5.2.5 电泳
用电泳缓冲液（1×TAE）制备1.8%～2.0%的琼脂糖凝胶，取5μLPCR扩增产物，分别和2μL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照，3～5V/cm恒压电泳，电泳20～40min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。
5.2.6 结果判定
在阴性对照未出现条带、阳性对照出现预期大小的扩增条带条件下，如检测样品未出现450bp大小的扩增带，则判为阴性；如检测样品出现450bp大小的扩增带，则判为阳性。
如果阴性对照和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，则本次检测结果无效，应重新试验。
