类脑研究（类器官研究进展）

类脑研究（类器官研究进展）类脑技术是由拟胚体技术发展而来的。拟胚体是通过让胚胎干细胞或多能干细胞脱离自我更新环境诱导其分化，胚胎干细胞或多能干细胞自发形成的一种多细胞的聚集体。研究发现，拟胚体的分化过程类似于胚胎在子宫内的早期分化。而科学家们发现拟胚体在matrigel胶包被的培养皿中，可以自发的向神经系统的细胞分化，并进一步的形成具有“顶部-底部”极性的神经上皮细胞和放射性胶质细胞。类脑技术的发展然而，模式动物毕竟不是人类，即使是与人类最为接近的巨猿，其脑组织的结构和发育特征还是与人类有一定差别。再加上脑组织的发育是伴随着胎儿在子宫内的生长而发生的，对人类组织进行研究还存在着很大的伦理挑战。也许有人会说，绕过模式动物差别和伦理挑战两座大山，我们也可以在体外实验室的培养皿里研究脑的发育啊。在类器官技术尚未发展之前，实验室的培养皿中培养人类大脑，简直是无法想象的难题。因为传统的细胞培养技术，是细胞们躺在培养皿的表面，

韩津 中科院再生医学

如果有人问，类脑有什么用，可以代替人类思考吗？很遗憾的，目前还不能。然而，作为一个重要的技术平台，类脑能够让我们更好的了解人类的脑组织是如何形成的，或者人类的脑组织是怎么生病的。本期，我们将向您详细介绍类脑（brain organoid）——脑发育和疾病研究的新平台

由于无法对人类的组织和器官直接开展研究，科学家们对脑（神经系统）的在体研究主要通过模式生物（生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象，这种被选定的生物物种就是模式生物，如：线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠等）。

科学家通过对模式动物使用药物或者基因改造的方法影响脑发育过程中的一些重要调控信号，从而确定某些特定的信号分子对脑发育的作用，或发现一些脑发育过程中的规律。在小鼠等模式动物中建立帕金森、亨廷顿舞蹈症、谱系自闭症等模型，在模式动物中研究发病机制和药物等治疗手段的有效性。

然而，模式动物毕竟不是人类，即使是与人类最为接近的巨猿，其脑组织的结构和发育特征还是与人类有一定差别。再加上脑组织的发育是伴随着胎儿在子宫内的生长而发生的，对人类组织进行研究还存在着很大的伦理挑战。

也许有人会说，绕过模式动物差别和伦理挑战两座大山，我们也可以在体外实验室的培养皿里研究脑的发育啊。在类器官技术尚未发展之前，实验室的培养皿中培养人类大脑，简直是无法想象的难题。因为传统的细胞培养技术，是细胞们躺在培养皿的表面，手拉着手肩挨着肩的一个扁平二维的培养体系，相对于人脑组织这样一个立体的多细胞的复杂组织来说，二维培养的方式是难于在体外重建脑组织的（但我们也决不能无视二维培养技术的价值，直到现在，科学家们仍在利用二维培养研究出了大量的重量级的生物发现）而利用类器官技术获得的类脑，它的重要特点就是具有三维的结构，由多种细胞组成，与人脑具有一定相似性的体外组织结构。可以说类脑在一定程度上解决了在培养皿中研究脑组织的技术难题。

图1 人的多能干细胞形成的类（大）脑组织，可见到神经前体细胞和神经元1

类脑技术的发展

类脑技术是由拟胚体技术发展而来的。拟胚体是通过让胚胎干细胞或多能干细胞脱离自我更新环境诱导其分化，胚胎干细胞或多能干细胞自发形成的一种多细胞的聚集体。研究发现，拟胚体的分化过程类似于胚胎在子宫内的早期分化。而科学家们发现拟胚体在matrigel胶包被的培养皿中，可以自发的向神经系统的细胞分化，并进一步的形成具有“顶部-底部”极性的神经上皮细胞和放射性胶质细胞。

最初这种拟胚体自发向神经系统分化模拟神经系统发育的研究是在二维的培养体系下以一种假复层的形式出现的2。随后，发展为悬浮成球的三维培养形式3，2011年，一种人胚胎干细胞三维培养体系下通过诱导细胞的自我组织而形成的视杯样结构很好的模拟了视网膜的结构4。

近几年中，类脑技术还在不断进步，三维的类脑组织可以模拟大脑的某些结构，并被称为“类大脑”，在这些类大脑中，可以实现对皮层结构的模拟，而皮层正是大脑实现信息处理的重要结构。除了自发分化的方法，利用外源信号分子的模拟发育早期命运决定信号诱导类（大）脑形成的方法中也不容忽视。虽然诱导类（大）脑的方法很多，但目标都是让获得的类脑更稳定、更成熟、结构的复杂度更高、更接近于人类的（大）脑。

图2 通过体外培养形成的类脑组织，左图中白色箭头所示为可见液体流动的脑室结构，右图中黑色箭头所示为视网膜色素上皮结构1

类脑技术的应用

第一部分：脑发育的模拟

虽然神经学的研究可以追溯到几百年前的文艺复兴时期，然而神经系统作为人类体内最为复杂的系统，它是如何从神经上皮的几十个细胞发育为由成百上千神经细胞组成的神经系统，人类至今尚未参透其中奥妙。通过模式动物、二维培养、神经解剖学和组织学……人类利用多种手段一层层揭开神经系统的面纱，类脑技术的建立和发展更为神经系统发育的研究装备了新的利器。

一、模拟人类神经发育

几乎所有的类脑模型中我们都可以看到放射性胶质细胞、中间前体细胞、深层以及表层神经元按照与大脑发育类似的时间顺序出现在类脑组织中。这显示了类脑技术在模拟神经系统发育方面的优势1。

更重要的是，类脑组织可以产生在模式动物小鼠中缺失的细胞类型和发育过程。比如一类位于大多数灵长类动物大脑室管膜下区外侧的外侧放射性胶质细胞（Outer radial glia cells oRG）。oRG细胞在鼠的脑中是不存在的，鼠作为脑发育模式动物是无法研究oRG细胞的发育和功能的，然而科学家们在类脑中利用标志物的标记和单细胞测序技术发现了oRG细胞的产生，这为科学家们在体外研究oRG细胞的发育提供了可能5。

皮层的扩展和折叠形成沟回这样的发育过程，也是无法在鼠脑的发育模型中研究的。2017年，Li Yun等科学家利用类脑技术发现了调控皮层扩展和折叠的信号分子，为脑皮层沟回形成的研究提供的重要数据6。

图3 利用人多能干细胞形成的类脑组织中，如果抑制PTEN信号，可以促进类脑组织表面结构的延展并折叠形成褶皱结构。这样的作用在鼠多能细胞形成的类脑中并没有被发现（Li Y. et al. Cell Stem Cell 2017）

二、获得多种类型的神经细胞

类脑组织的细胞的种类和多样性能否模拟人脑？科学家们通过RNA测序方法对类脑组织的细胞组成进行了分析发现，体外培养100天的类脑组织的转录组与孕17-24周的人脑相似7。更精确的单细胞测序研究进一步证明了类脑组织细胞的多样性和复杂性，但也提示了一些形成类脑的方法可能会引入中胚层细胞（神经细胞属于外胚层），或者某些类型的细胞只能在某种特定方法生成的类脑中产生。

除了通过自发分化的的方法获得类脑组织，科学家们还试图通过外源加入一些已知的发育调控信号分子获得一些并不常见的神经细胞。

三、类脑融合技术研究复杂神经结构

通过加入外源因子，可以诱导多能干细胞形成类脑组织，通常这种类脑组织与通过自发分化形成的类脑组织相对应，被称作外源类脑组织，而由自发分化而来的则称为内源类脑组织。

将不同的外源类脑组织进行融合获得复杂的神经结构为科学家研究复杂神经结构的形成过程提供了平台。其中最为成功的是中间神经元迁移模型8。利用不同外源因子诱导分别获得模拟富含兴奋性神经元的背侧皮层类脑和模拟富含抑制性神经元的腹侧皮层类脑，通过将这两种类脑融合，科学家们在背侧类脑中发现了抑制性中间神经元的迁入。

这个模型很好的模拟了体内中间神经元的迁移过程，已经有科学家利用该模型研究外源信号分子对神经元迁移作用。

图4 用红色和绿色荧光标记的人多能干细胞分别向背侧和腹侧皮层类脑诱导，当这两种类脑共同培养时发现，它们能够融合并看到其内部大量腹侧类脑细胞向背侧类脑迁移（Bagley J.A. et al. Nat Methods 2017）

四、应用于脑发育过程的表观遗传学研究

科学家们还将类脑组织用于研究胚胎期表观遗传学信号分子对神经发育的影响，研究中虽然发现了一些与体内发育类似的DNA甲基化行为，但也有一些表观遗传现象并不存在于人类的脑中9。这一研究提示我们类脑技术还需要进一步的完善，使其更好的模拟脑的发育过程。

五、研究组织器官发生中的组织者

不论了外源还是内源类脑组织，类脑的形成在一定程度上都需要内部的自我组织。在体内，一个称为“皮层下摆”的细胞群体，他们表达WNT、BMP等信号分子，被认为担负着脑发育过程中组织者的职能。科学家们在类脑组织中也发现了一群类似的细胞，他们表达WNT和BMP信号，这群细胞可能模拟了脑形态建成过程中组织者的作用10。

六、研究功能皮质回路的形成

形成功能皮质回路的关键在于神经元之间形成能够传递信号的突触连接，而神经元之间形成功能性的突触连接是干细胞分化为神经元后更加重要的发育过程，这一过程从胚胎期开始伴随着人类的成长，与人类的学习、认知、记忆等活动有着密不可分的关系。

在类脑组织中是否观察到功能皮质回路呢？在自发分化180天的类脑组织和由外源类脑组织融合形成的中间神经元迁移模型中均观察到了谷氨酸能神经元与GABA能神经元形成的功能回路。电生理实验检测到功能神经信号的传导，扫描电子显微镜观察到突触结构，这些都说明，类脑组织中的神经元是可以形成突触连接并进而形成功能皮质环路的11。这将为神经回路形成的研究提供体外的研究平台。

未完待续……类脑（下）将继续为大家介绍类脑技术在脑疾病模拟中的应用，以及类脑技术的未来与挑战，敬请期待。

参考文献：

Lancaster M.A. et al. Cerebralorganoids model human brain development and microcephaly. Nature 501 373-9(2013).

Ying Q.L. Stavridis M. Griffiths D. Li M. & Smith A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermalprecursors in adherent monoculture. NatBiotechnol 21 183-6 (2003).

Watanabe K. et al. Directeddifferentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci 8 288-96 (2005).

Eiraku M. et al. Self-organizing optic-cupmorphogenesis in three-dimensional culture. Nature472 51-6 (2011).

Bershteyn M. et al. Human iPSC-DerivedCerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and RevealProlonged Mitosis of Outer Radial Glia. CellStem Cell 20 435-449 e4 (2017).

Li Y. et al. Induction of Expansion andFolding in Human Cerebral Organoids. CellStem Cell 20 385-396 e3 (2017).

Camp J.G. et al. Human cerebral organoidsrecapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A 112 15672-7 (2015).

Bagley J.A. Reumann D. Bian S. Levi-Strauss J. & Knoblich J.A. Fused cerebral organoids modelinteractions between brain regions. NatMethods 14 743-751 (2017).

Luo C. et al. Cerebral OrganoidsRecapitulate Epigenomic Signatures of the Human Fetal Brain. Cell Rep 17 3369-3384 (2016).

Kadoshima T. et al. Self-organization ofaxial polarity inside-out layer pattern and species-specific progenitordynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A 110 20284-9 (2013).

Birey F. et al. Assembly of functionallyintegrated human forebrain spheroids. Nature545 54-59 (2017).