microrna逆转录（简述microRNA的反转录策略）
microrna逆转录（简述microRNA的反转录策略）考虑到表达量的差异范围、高特异性和敏感性，茎环法反转录(Stem-loop RT)为基础的检测是目前公认的比较好的检测方式。茎环法顾名思义就是反转录过程中使用的是带有茎环结构的引物，例如GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC，其中有一段互补配对可以形成一个茎环样（stem-loop）的结构，茎环一端的5-8个碱基则是用来识别miRNA与之结合。形成茎环的目的有二，一方面能够有效延长长度，另一方面又可利用自身的互补构象防止与其他序列结合，从而减少了非特异结合。不过茎环法反转录的特异性引物序列决定了对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的反转录引物来配置不同的逆转录体系，从原理上决定了不利于高通量检测，一般更推荐用于少量目标miRNA的定量检测。miRNA反转录的各种方法核心思想都在于延长，通过RT引物添加一段序列来延长反转录cDNA分子的
原创 NJU_LB 阿尔法医学英语 昨天
在前面的推送中，我们曾和大家分享过microRNA(下称miRNA)这一类非编码RNA（non-coding RNA），它们广泛存在于动植物体内，含量与种类丰富，参与众多生理病理过程的调节，也被视作一些疾病早期诊断、预后评估的重要生物标志物(biomarker)。在关注miRNA的生物学功能（质）的同时，它的表达量对于生物学作用的发生同样至关重要，而定量的第一步即是反转录成cDNA。
前情回顾——microRNA的生物合成（biogenesis）
成熟miRNA的根源来自于一段叫做primary-miRNA(pri-miRNA)的长RNA 在细胞核中经过RNA酶复合物(RNase complex)的处理产生生成60nt左右的茎环结构的pre-miRNA。接着pre-miRNA转运到胞浆内，被RNase Dicer剪切进一步加工，最终形成成熟的miRNA。大多数情况下，茎环的一侧加工成成熟的miRNA，通过结合在特定mRNA的3'-UTR上互补序列发挥作用（也可结合到5'-UTR或编码区）。也有部分情况下两边都能保留，形成两条不同的成熟miRNA。pri-和pre-miRNA通常都会被降解，也有部分特例这两者在细胞中仍保留较高丰度而发挥生物学作用。
困难——microRNA反转录的困难（biogenesis）
根据上面的生物合成过程可知，成熟的miRNA的长度仅有22nt左右，而一般的PCR要求模板链至少是引物长度的两倍以上，而典型的模板链长度就20nt左右了，显然不适用于miRNA。总的来说，miRNA检测和定量的困难在于：①长度仅22nt左右，不适用传统的RT-qPCR引物或杂交探针（hybridization probes）；②尽管miRNA含量丰富，但不同miRNA之间表达量相差很大，需要检测方法宽容度大；③miRNA不仅长度短，并且序列很相似；④细胞中同时存在有pri-miRNA、pre-miRNA、mature miRNA多种形式，需要加以区分。
茎环法反转录简介（Stem-Loop RT-qPCR）
miRNA反转录的各种方法核心思想都在于延长，通过RT引物添加一段序列来延长反转录cDNA分子的长度，而后在qPCR中一端用miRNA特异引物另一端用通用引物进行扩增，即可对miRNA的表达量进行定量。
考虑到表达量的差异范围、高特异性和敏感性，茎环法反转录(Stem-loop RT)为基础的检测是目前公认的比较好的检测方式。茎环法顾名思义就是反转录过程中使用的是带有茎环结构的引物，例如GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC，其中有一段互补配对可以形成一个茎环样（stem-loop）的结构，茎环一端的5-8个碱基则是用来识别miRNA与之结合。形成茎环的目的有二，一方面能够有效延长长度，另一方面又可利用自身的互补构象防止与其他序列结合，从而减少了非特异结合。不过茎环法反转录的特异性引物序列决定了对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的反转录引物来配置不同的逆转录体系，从原理上决定了不利于高通量检测，一般更推荐用于少量目标miRNA的定量检测。
与之类似的思路，另一种常见的逆转录策略是给所有miRNA无差别的加上polyA尾巴来延长cDNA长度，优点在于使用加尾酶一次处理所有miRNA，便于大范围筛选，不过相应的特异性就有所牺牲。以上就是本期介绍的microRNA的反转录策略，当反转录成cDNA之后，后面的实时荧光定量PCR就顺手拈来了，对microRNA的定量分析也就实现了，进一步可以对其生物学功能进行验证或探索。参考：1. Kramer M. F. Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Curr. Protoc. Mol. Biol. 1–15 1. Park D. J. Lariat-dependent nested PCR for flanking sequence determination. Methods in molecular biology (Clifton N.J.) vol. 687.
