piRNA与肿瘤研究进展：piRNA与肿瘤研究进展
piRNA与肿瘤研究进展：piRNA与肿瘤研究进展Girard等在睾丸总RNA分离过程中也检测到了这种小RNA，它与MIWI蛋白（一种鼠科的Piwi蛋白）结合。他们用小鼠17号染色体，大鼠20号染色体和人的6号染色体进行分析，发有类似的piRNA，大多数基因簇出现在同线位置上。GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etal．《Agermline specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins》．Nature，2006，442（7099）：199～202AravinA，GaidatzisD，PfefferS，etal．《A novel class of small RNAs bind to MILI proteinin mouse testes》．Nature，2006，442（7099）：203～207Aravin等发现了该种小RNA，他们在3
piRNA与肿瘤研究进展
导语
近年来piRNA在癌症基因组中作用正成为研究热点。最初发现piRNA对生殖相关时间发挥重要作用，在人类基因组中已经发现超过20000个piRNA。与miRNA相比，piRNA与PIWI蛋白相互作用，初始功能发生在细胞核内，PIWI是Argonuate蛋白家族的成员之一。PIWI/piRNA 通过表观遗传水平和转录后水平沉默转座子等自私性遗传元件，维持生殖细胞基因组的稳定性和完整性。PIWI/piRNA 还可以通过转录后水平调控蛋白质编码基因。最近研究发现piRNA组织特异性在人的各种体细胞组织中表达。越来越多的研究表明piRNA异常表达是多种类型肿瘤的标志性特征，然而它们特定致癌功能仍不清楚。本文讨论piRNA起源、机制、功能以及在肿瘤中的作用及其临床应用的潜力。
非编码RNA类型和功能的多样性
AravinA，GaidatzisD，PfefferS，etal．《A novel class of small RNAs bind to MILI proteinin mouse testes》．Nature，2006，442（7099）：203～207
Aravin等发现了该种小RNA，他们在3个月大的C57BL/6J雄性小鼠中从小鼠全睾丸组织的全细胞裂解液中利用免疫共沉淀技术纯化并获得MILI核糖核蛋白复合体。该复合体中含有
26-28nt RNA进行凝胶纯化，克隆和测序。他们根据Piwi蛋白家族的成员MILI与这些小RNA的相互作用，命名为Piwi interacting RNAs，即piRNAs。
GirardA，SachidanandamR，HannonGJ，etal．《Agermline specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins》．Nature，2006，442（7099）：199～202
Girard等在睾丸总RNA分离过程中也检测到了这种小RNA，它与MIWI蛋白（一种鼠科的Piwi蛋白）结合。他们用小鼠17号染色体，大鼠20号染色体和人的6号染色体进行分析，发有类似的piRNA，大多数基因簇出现在同线位置上。
LauNC，SetoAG，KimJ，etal．《Characterization of the piRNA complex from rattestes》．Science，2006，313（5785）：363～367
GrivnaST，BeyretE，WangZ，etal．《A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells．Genes&Dev，2006，20（13）：1709～1714
此外，相继有3篇文章也分别报道了在小鼠的生精细胞、生殖系细胞以及睾丸中发现了piRNA
其中日本的实验室根据来源将其命名为germline small RNA（gsRNA），由于命名原则的不同，故在名称上存在一定的差异。
piRNA的起源
Yuka W. Iwasaki Mikiko C. Siomi and Haruhiko Siomi 《PIWI-Interacting RNA: Its Biogenesis and Functions》，Annual Review of Biochemistry，2015，Vol. 84: 405-433
piRNA 来源于基因组中的piRNA 簇(piRNA cluster) 或转座子区域，由长的单链转录本切割产生。成熟的piRNA 24-32 nt。之前的研究使人们对piRNA 的生物发生有了较深入的了解。piRNA 在动物界广泛表达，目前尚未在植物中检测到。除线虫外，从海绵动物(sponges) 到高等哺乳动物中保守存在两条piRNA 生成途径：
初级生成途径（primary pathway）：初级生成途径主要发生在体细胞中，主要由单链piRNA 簇、双链piRNA簇、基因来源的piRNA和转座子来源的生成途径。单链的piRNA前体加工成piRNA中间体后于Piwi蛋白结合发生细胞核或者细胞质沉默事件。
次级生成途径（secondary pathway）：初级生成途径主要发生在生殖细胞中，PIWI 家族在果蝇中有3 个成员——Piwi、Aub和Ago3，其中Piwi 和Aub 结合初级piRNA。由初级加工途径生成的Aub-piRNA 大多来源于转座子的反义链，可以通过序列互补配对识别正义链的转录本，然后由Aub 切割形成次级piRNA 的5' 端，并装载到Ago3 上，再通过与初级加工途径类似的3'端修剪、甲基化修饰等过程得到正义链来源的次级piRNA。Ago3- 次级piRNA 复合物再以同样的机制剪切产生反义链的Aub- 次级piRNA，即被称作乒乓循环(ping-pang cycle)的piRNA 次级加工途径。小鼠睾丸中同样存在由Mili 和Miwi2介导的乒乓循环。事实上，已有研究报道次级通路在多种脊椎动物，甚至是无脊椎海绵动物中保守存在，提示这一过程具有重要的生物学意义。目前认为，来源于piRNA基因簇的初级piRNA 可以广谱靶向细胞中的各种遗传元件，而次级通路则针对有活性的转座子序列扩增特异性的piRNA，发挥沉默转座子的作用。
piRNA的结构特征
piRNA是一类长度为26～31nt单链的小RNA，大部分集中在29～30nt，与miRNA和rasiRNAs一样，5′端也具有强烈的尿嘧啶倾向性（约86%）。
piRNA 3'末端的2'氧甲基化修饰，文献报告修饰被PIWI蛋白的PAZ结构域识别，具体机制不太明晰。
piRNA无明显特殊性的二级结构特异基序和特征。
piRNA在染色体上的分布极不均匀，在小鼠中它们主要分布于17、5、4、2号染色体上，而很少分布于1、3、16、19和X染色体上，基本不分布于Y染色体上。
piRNA主要存在于基因间隔区，而很少存在于基因区或重复序列区。它们主要成簇分布在1～100kb相对较短的基因组位点，且包含有10～4500个小分子RNA。由于piRNA成簇分布，且每一个几乎都具有同一取向，说明同一簇piRNA可能来源于同一长初始转录物，但有一部分成簇的piRNA会突然改变取向，说明这些双向的成簇piRNA可能由相同的启动子按不同的方式转录而来。
miRNA与piRNA特性比较
Betel D Sheridan R Marks D S et al.《Computational analysis of mouse piRNA sequence and biogenesis》. PLoS Comput Biol 2007 3(11): e222.
piRNA生物学功能
A.piRNA调控果蝇早期胚胎发育
2001年，Aravin 等发现，果蝇Y 染色体上与Stellate同源的假基因Su(Ste) 编码一类小RNA，其长度大于siRNA，与PIWI 家族蛋白Aub 相互作用，即现在熟知的piRNA。Su(Ste)基因缺失或aub突变即检测不到Su(Ste) 来源的piRNA，同时导致Stellate蛋白积累、果蝇雄性不育。后续的研究发现，Aub-Su(Ste)piRNA通过在转录后水平降解成熟的mRNA，实现对Stellate基因表达的负调控。
B.piRNA参与家蚕性别决定
家蚕piRNA的最新研究发现，来自性染色体的FempiRNA通过直接切割靶mRNA参与性别决定。家蚕采用ZW性别决定系统，即雄性携带两条Z染色体，而雌性携带1条Z染色体和1条W染色体。决定性别的W染色体几乎全部为转座子序列，至今未鉴定出蛋白质编码基因。W染色体的转录本可以作为piRNA前体，加工成29nt的Fem piRNA，在雌性家蚕中特异性表达。在家蚕胚胎中转染Fem piRNA的反义链RNA或通过siRNA下调家蚕PIWI蛋白Siwi表达，均导致雌性家蚕出现雄性化特征。
C.piRNA介导mRNA衰减
《PIWI/piRNA调控基因表达研究的新进展》DOI: 10.13376/j.cbls/2015046
2010 年，Rouget等报道发现果蝇piRNA参与早期胚胎中母源mRNA 的降解。胚胎发育早期，随着早期胚胎转录机器的启动，母源mRNA逐渐被胚胎mRNA 取代，被称作母源-合子过渡(maternal-to-zygonic transition)。过渡过程中，母源mRNA 的降解通过CCR4-NOT脱腺苷酸复合物介导。
D.piRNA调控基因表达的机制
对线虫piRNA (21U-RNA)的一系列研究，揭示了piRNA 在基因表达调控中的双重功能。线虫piRNA 由单个的转录小单元编码，其序列可覆盖几乎所有的蛋白质编码基因。线虫piRNA 执行生殖细胞的全基因组转录本监测任务，一方面通过可遗传的RNA 诱导的表观遗传沉默途径(RNA-induced epigenetic silencing pathway RNAe) 沉默外源的“非我”(non-self) 基因；一方面保护内源基因mRNA的稳定性，并激活其表达。21U-RNA 加载到线虫PIWI 蛋白PRG-1 上，通过序列不完全互补配对识别靶mRNA，招募RNA 依赖的RNA聚合酶(RdRP)合成与mRNA 完全互补配对的22G-RNA。22G-RNA 可以与两种Argonaute 蛋白结合，与WAGO蛋白结合则招募组蛋白甲基转移酶启动RNAe，抑制外源mRNA 表达；与CSR-1 结合则保护内源靶mRNA 不受RNAe沉默，并激活其表达。21U-RNA对基因表达双向调控的确切机制还有待于进一步的研究。
D.piwi-piRNA在果蝇中调控表观遗传沉默
E.piRNA调控转座
转座元件是一类存在于多细胞生物基因组中的不稳定元素，它们可以通过频繁跳跃将自身插入到基因组的其它位点，从而实现对基因结构和表达的改变，对物种进化具有重要意义。然而，如果转座元件在基因组中毫无约束地随意移动，则会破坏基因组的稳定性和完整性，危害个体的生存。因生殖细胞担负着传代的重任，其基因组的稳定性和完整性尤为重要。因此，在选择压力下，动物生殖系细胞可能就进化获得了PIWI/piRNA这样一条独特小RNA通路，用于控制转座子、逆转座子等自私性基因元件的活性，维持生殖细胞基因组稳定性及完整性。
piRNA生物学功能核心组件PIWI蛋白
Argonaute蛋白家族可分为AGO和PIWI两个亚家族成员，它们在物种间高度保守，并在小分子非编码RNA调控途径中发挥核心作用。其中AGO蛋白质成员特异性地与小分子干扰RNA(small interfering RNA siRNA) 和microRNA(miRNA)结合，在多种组织器官中发挥重要功能。而PIWI蛋白质特异性地在动物生殖系细胞中表达，特异性地结合piRNA，在动物生殖细胞发育和配子生成过程中发挥多种重要功能。
Argonaute家族蛋白质含有保守的PAZ(Piwi Argonaut and Zwille)结构域和PIWI结构域。结构及生化研究表明，AGO/PIWI蛋白质通过PAZ结构域与小分子RNA的3′末端结合，而PIWI结构域及MID结构域(the middle domain)结合RNA分子的5′末端。PIWI结构域含有RNase H的催化结构域，一部分Argonaute 成员具有核酸内切酶活性，可在对应于向导小RNA分子第10位与11位碱基之间切割靶RNA链piwi是进化上非常保守的一类基因，最早在果蝇中被发现，对果蝇生殖干细胞的自我更新和维持是必需的。随后，研究人员通过功能缺失突变实验发现，piwi基因缺失也导致线虫、斑马鱼及小鼠等模式生物生殖细胞发育受阻。这些研究表明，PIWI蛋白主要在动物生殖细胞中表达，其功能与生殖事件相关。
在小鼠中，PIWI蛋白家族包括三个成员：MIWI2、MILI和MIWI，它们在小鼠雄性生殖细胞的发育分化过程中呈现高度时空特异性表达。
Piwi类系物表达
piRNA在肿瘤中的研究迎来井喷
从2006年发现piRNA开始piRNA研究趋势很明显，文献发表数量急剧增加。
piRNA在体细胞中表达具有组织特异性
在乳腺，肺和胃组织中进行piRNA测序和表达谱分析，发现piRNA具有组织特异性。
piRNA在肿瘤中异常表达
piRNA与临床
Piwi相互作用RNA（piRNA）是一类新发现的非编码小RNA，又称第三类小RNA。它们具有基因表达调控的功能，但与肿瘤发生、发展的关系非常仍然不太清晰。宁波大学郭俊明在胃癌中
（1）发现了在胃癌组织中异常表达的piRNA。经piRNA芯片检测胃癌组织和癌旁组织中piRNA的表达，发现一些差异表达的piRNA，其中piR-651和piR-823的表达差异具有统计学意义。
（2）揭示了胃癌组织与癌旁组织piRNA表达谱的差异。发现胃癌组织中piR-823的表达水平明显低于癌旁组织中的表达水平，而piR-651的表达则相反。发现piR-651和piR-823分别高表达于和低表达于胃癌组织中，并于胃癌患者的临床病理因素相关。
（3）胃癌细胞株与正常胃上皮细胞中piR-823表达差异的研究。发现胃癌细胞中piR-823的表达明显低于正常胃上皮细胞中的表达。
（4）多种肿瘤组织中piR-823表达差异的研究。发现，结肠癌和肺癌组织中，piR-823的表达高于相应癌旁组织。
（5）piR-823类似物抑制胃癌细胞的生长。把piR-823类似物导入到胃癌细胞中，MTT结果显示MGC-803和SGC-7901的生长均以剂量依赖方式受到抑制。
（6）piR-651抑制剂通过影响细胞周期抑制胃癌细胞的生长，机制研究说明其阻止胃癌细胞于G2/M期。
（7）动物实验说明piR-823具有抑制肿瘤细胞生长的作用。
（8）外周血piRNA检测用于胃癌诊断的价值研究。胃癌患者外周血piR-651和piR-823的水平明显不同于正常人外周血中的水平；腺癌患者外周血piR-651的水平明显高于印戒细胞癌的水平；piR-823 的水平与TNM分期和远处转移有关。piR-651、piR-823单独使用和联合使用的ROC曲线下面积分别为0.890、0.810和0.892；它们的阳性检测率均高于CEA的检测率。
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