促进浆细胞和骨髓瘤细胞融合：T细胞治疗转移性髓母细胞瘤和室管膜瘤的临床前研究

促进浆细胞和骨髓瘤细胞融合：T细胞治疗转移性髓母细胞瘤和室管膜瘤的临床前研究（图1a：研究的主要流程）利用6-8周龄免疫缺陷小鼠构建G3型MB原位小脑异种移植肿瘤模型。利用立体定向技术向小脑注射50000个细胞。选取的G2型MB细胞系为MED114FH（患者6岁，LCA型）、MED411FH（患者3岁，LCA型）和MDT-MMB（MYC扩增阳性）。肿瘤细胞转导eGFP-firefly荧光素酶基因，每周进行生物发光成像（BLI）一次。当荧光成像信号达到一定强度时，将CAR或未转导的T细胞（5*106）注入小鼠侧脑室，直至出现临床症状/达到人道终点（图1a）。研究结果1、G3型MB的靶点选择和模型构建为了确定G3型髓母细胞瘤CAR-T细胞治疗的候选靶点，研究者分析了763分子分型已知的人类髓母细胞瘤标本（WNT型70例；SHH型223例；G3型144例；G4型326例）和9例正常大脑对照样本（n=5例成人小脑；4例胎儿小脑）的微阵列数据。EPHA2、HER2和白细胞介

研究背景

髓母细胞瘤是最常见的儿童恶性脑肿瘤，室管膜瘤是第三常见的儿童恶性脑肿瘤，二者的靶向治疗进展缓慢：①肿瘤突变负荷低，缺乏可靶向的体细胞单核苷酸突变；②血脑屏障限制了口服或静脉给药的疗效；③患者的异质性：髓母细胞瘤有12个分子亚型；室管膜瘤有9个分子亚型；④肿瘤内的异质性、原发肿瘤和转移瘤之间的生物学差异。

与脑实质内肿瘤不同，髓母细胞瘤和室管膜瘤都有沿软脑膜播散的倾向，肿瘤浸润于脑脊液中，这就为复发病灶的局部治疗提供了机会。

既往研究已观察到，向瘤腔内或静脉注射HER2 CAR T细胞可使髓母细胞瘤体积持续缩小。本研究通过鉴定髓母细胞瘤和室管膜瘤原发/转移灶中一致存在的抗原表位，设计针对这些抗原表位的CAR T细胞，并直接注射至脑室内，以观察上述治疗对复发播散髓母细胞瘤和室管膜瘤的疗效。

研究结果

1、G3型MB的靶点选择和模型构建

为了确定G3型髓母细胞瘤CAR-T细胞治疗的候选靶点，研究者分析了763分子分型已知的人类髓母细胞瘤标本（WNT型70例；SHH型223例；G3型144例；G4型326例）和9例正常大脑对照样本（n=5例成人小脑；4例胎儿小脑）的微阵列数据。EPHA2、HER2和白细胞介素（IL）-13受体α2（IL-13Rα2）在G3型MB中与正常大脑相比存在高表达。比较G3型髓母细胞瘤原发和转移/复发病灶样本中EPHA2、HER2和IL-13Rα2的表达，发现转移瘤内蛋白质表达水平保持一致。因此研究者选择了EPHA2单价CAR-T细胞以及三价CAR-T细胞，前者在髓母细胞瘤样本中具有最高和最保守的蛋白表达，而后者在GBM动物模型中证实能克服患者间异质性。

利用6-8周龄免疫缺陷小鼠构建G3型MB原位小脑异种移植肿瘤模型。利用立体定向技术向小脑注射50000个细胞。选取的G2型MB细胞系为MED114FH（患者6岁，LCA型）、MED411FH（患者3岁，LCA型）和MDT-MMB（MYC扩增阳性）。肿瘤细胞转导eGFP-firefly荧光素酶基因，每周进行生物发光成像（BLI）一次。当荧光成像信号达到一定强度时，将CAR或未转导的T细胞（5*106）注入小鼠侧脑室，直至出现临床症状/达到人道终点（图1a）。

（图1a：研究的主要流程）

图1b：CAR T治疗的三种移植瘤模型小鼠生存分析；图1c：CAR T治疗对Med114FH小鼠的BLI及HE染色分析，图示接受EPHA2 CAR T细胞或TRI CAR T细胞治疗的小鼠在注射1个月后肿瘤缩小，但后续肿瘤出现进展

2、CAR T治疗G3型MB的效果

单剂三价CAR T细胞较未转导的T细胞显著提高了两种原位移植瘤模型小鼠的总生存 (Med114FH，P<0.005；Med411FH，P<0.05)。单剂EPHA2 CAR T细胞显著提高了三种原位移植瘤模型小鼠的总生存 (与未治疗相比P<0.005；与非转导T细胞相比P<0.005)。EPHA2 CAR T和三价 CAR T细胞治疗对Med114FH和Med411FH的总生存无显著差异，EPHA2较三价CAR T显著提高了MDT-MMB小鼠的总生存（P<0.005）。虽然接受EPHA2 CAR T细胞或TRI CAR T细胞治疗的小鼠在注射1个月后肿瘤缩小，但在终点解剖小鼠，仍可见大量肿瘤细胞，提示疗效持续时间有限，肿瘤最终进展（图1b-c）。

在三分之一的髓母细胞瘤模型中，两剂TRI CAR T细胞与单剂TRI CAR T细胞相比，可延长小鼠的总生存时间，而两剂EPHA2 CAR T可改善Med114FH和Med411FH小鼠的总生存和MDT-MMB小鼠的无进展生存。重复输注EPHA2有效清除了原发和转移肿瘤。因此，脑室注射CAR T细胞是治疗G3型原发和转移性髓母细胞瘤的一种有效的方法，重复给药可能会提供额外的临床获益（图2b-c）。

图2b-c：两剂CAR T治疗的三种移植瘤模型小鼠生存分析和疗效分析，显示重复输注EPHA2有效清除了原发和转移肿瘤

3、PFA型EPM的靶点选择以及CAR-T治疗PFA型EPM的效果

为了确定PFA室管膜瘤的候选CAR T细胞靶点，研究者分析了100个室管膜瘤样本（PFA：54例、脊髓：15例、RELA：31例）的RNA表达谱。确定了与髓母细胞瘤相同的三个差异表达基因EPHA2、HER2和IL-13Rα2。在蛋白表达层面，EPHA2、HER2和IL-13Rα2在室管膜瘤中蛋白水平呈高表达。在原发病灶和与之相匹配的复发病灶之间，蛋白质的表达也是稳定的。研究者选择了单价HER2 CAR T细胞、三价CAR T细胞进行研究。

HER2 CAR T细胞和三价 CAR T细胞治疗组小鼠的存活率显著高于非转导T细胞治疗组小鼠(MDT-PFA4，P<0.005；MDT-PFA5，P<0.05；EP612，P<0.05)；在三种PFA室管膜瘤模型中，单价HER2 CAR T细胞治疗和TRI CAR T细胞的疗效之间没有显著差异。所有接受非转导T细胞治疗的小鼠在终点时都存在残余肿瘤。单价HER2 CAR T细胞治疗的小鼠在终点时肿瘤负荷显著降低，其中一只小鼠（1/5）未见明显肿瘤。TRI CAR T细胞治疗后1月可见肿瘤缩小，其中2只小鼠（2/5）未见明显肿瘤。因此，脑室注射CAR T细胞是对PFA型室管膜瘤是一种有效的治疗方法（图略，详见原文）。

图4b，扩展图9a-b：静脉注射和脑室内注射CAR T的疗效对比

4、静脉输注和脑脊液输注CAR T细胞的疗效对比

为了确定CAR T细胞的最佳输注方法，研究者比较了脑室内注射和经尾静脉注射单剂CAR T细胞对原位MB移植瘤模型小鼠的疗效。静脉注射EPHA2 CAR T细胞相较于未治疗组可显著提高三种模型小鼠的总生存。相较于未转导T细胞可提高2种模型小鼠的总生存（Med411FH，MDT-MMB）。但是，静脉注射使肿瘤缩小不明显。而脑室内给药相较于静脉注射可改善三种模型小鼠的总生存，比静脉注射更有效。

将非转导T细胞或三价CAR T细胞采用两种途径输注，采用5×106至10×106这两种剂量均未能改善存活或肿瘤负荷。脑室内注射上述两种剂量的EPHA2 CAR T细胞相较于静脉注射可明显降低肿瘤负荷。但下降至2.5×106时不能有效清除肿瘤，因此确定脑室内注射的最佳剂量为5×106细胞（图4b，扩展图9a-b）。

5、CAR T与化疗药物的联合应用

CAR T细胞治疗失败的机制之一是抗原逃逸，该现象继发于CAR T细胞靶向基因的表观遗传沉默。5’-氮胞苷是一种去甲基化药物，可共价捕获DNA甲基转移酶，导致基因组DNA去甲基化，诱导细胞死亡。同时可短暂增加肿瘤相关抗原的表达。另外，5’-氮胞苷具有免疫调节作用，可使肿瘤细胞对CD8 T细胞敏感，刺激调节性CD4 T细胞和CD8 T细胞的增殖。单剂EPHA2 CAR T细胞联合5’-氮胞苷相较于单独应用EPHA2 CAR T细胞、单剂TRI CAR T细胞联合5’-氮胞苷、未转导T细胞联合5’-氮胞苷对髓母细胞瘤模型小鼠具有显著的生存优势（图5b）。采用相同的研究方法对室管膜瘤模型小鼠进行研究，在三种PFA室管膜瘤模型中，表观遗传调节剂和免疫治疗相结合的方法疗效最佳，在每一只受试小鼠中都观察到了肿瘤的清除和生存期的延长。

图5b：CAR T细胞联合5’-氮胞苷治疗的MB小鼠移植瘤模型生存分析，图示单剂EPHA2 CAR T细胞联合5’-氮胞苷具有明显的优势

讨论与结论

本研究发现，多数G3型MB存在EphA2、IL-13Rα2蛋白表达升高，包括HER2表达的小幅升高。这些蛋白可能是CAR T细胞疗法的良好靶点。在动物模型中，脑脊液局部输注单价EPHA2、HER2和三价CAT T细胞可对髓母细胞瘤和室管膜瘤产生良好的疗效。

在G3型髓母细胞瘤中，原发和复发肿瘤EPHA2的表达水平最高，研究中也观察到单价EPHA2 CAR T细胞的疗效优于三价CAR T细胞，因此，EPHA2 CAR T细胞可能是未来治疗G3型髓母细胞瘤的最优选择。对于原发和复发室管膜瘤，EPHA2、HER2和IL-13Rα2表达水平相似，因此三价CAR T细胞可能是未来的最优选择。与静脉注射相比，将CAR T细胞直接注入脑室内可提高疗效，并可能降低CAR T细胞对全身其他组织和器官的毒性。在未来的临床研究中，可通过Ommaya囊实现。另外，重复输注的效果优于单次输注。本研究发现，联合DNA去甲基化药物5’-氮胞苷可提高CAR T细胞疗法的疗效，因此探索5’-氮胞苷的作用机制也是未来的研究重点。

目前，复发G3型MB和室管膜瘤缺少有效的靶向药物，脑室内输注CAR T细胞可能是行之有效的治疗手段。

参考资料：Laura K. Donovan et al. Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma. Nature Medicine 2020.26:720-731.

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编 译：赵 赤

审 校：张俊平