碱性裂解法提取质粒dna实验报告：土壤中微生物总DNA的提取

碱性裂解法提取质粒dna实验报告：土壤中微生物总DNA的提取（1）裂解细胞。方法包括：①物理法，如玻璃珠研磨振荡、超声波、微波、冻融、煮沸、研钵研磨等。②化学法，如用表面活性剂SDS、热酚、高盐等。③酶解法，如用裂解酶、溶菌酶、蛋白酶、无色肽酶、链霉蛋白酶等。④联合裂解法，是物理、化学方法的综合利用。1．从土壤中提取微生物总DNA2．试剂DNA抽提缓冲液（根据提取方法选择）、SDS（十二烷基磺酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸）、DNA Marker、苯酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1）、70％酒精，16S rDNA通用引物。3．仪器和用具离心机、水浴锅、电泳仪及电泳槽。【实验设计思路】

【研究背景】

土壤是微生物栖居的主要场所。微生物在土壤中的分布及生命活动与土壤肥力、植物营养、植物病害和植被状况等密切相关。微生物是生态系统的重要组成部分，推动着能量流动和物质循环，在生物地球化学循环中扮演着重要的角色，许多酶和抗生素等生物活性物质均来自于微生物。据统计，每克土壤约含有107个微生物细胞，但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01％～10％而大部分微生物处于不可培养的状态，因此，相当多的菌种由于无法培养而不能被充分的​开发和利用。另外，土壤微生物对所生存的微环境十分敏感，是常用的土壤生态系统变化的预警及敏感指标。将近些年发展起来的分子生物学技术（如PCR-DGGE、ARDRA、RFLP等）运用到土壤微生物生态学的研究，可避开传统的微生物分离培养过程，直接探讨土壤中微生物的多样性变化及其与环境的关系，克服因土壤微生物可培养性的差异引起的分析偏差。这些分子生物学方法主要通过提取土壤中微生物总DNA，并对特定DNA序列（如16S rDNA基因）进行扩增，通过分析扩增产物的多样性来推断微生物群落的多样性。因此，从自然环境土壤中提取高纯度、高质量的微生物总DNA对后续研究都是相当重要的。

【实验器材】

1．实验材料不同生态环境的根际土壤样品。

2．试剂DNA抽提缓冲液（根据提取方法选择）、SDS（十二烷基磺酸钠）、EDTA（乙二胺四乙酸）、DNA Marker、苯酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1）、70％酒精，16S rDNA通用引物。

3．仪器和用具离心机、水浴锅、电泳仪及电泳槽。

【实验设计思路】

1．从土壤中提取微生物总DNA

（1）裂解细胞。方法包括：①物理法，如玻璃珠研磨振荡、超声波、微波、冻融、煮沸、研钵研磨等。②化学法，如用表面活性剂SDS、热酚、高盐等。③酶解法，如用裂解酶、溶菌酶、蛋白酶、无色肽酶、链霉蛋白酶等。④联合裂解法，是物理、化学方法的综合利用。

（2）提取核酸。一般采用酚／氯仿／异戊醇抽提法。

（3）核酸的纯化。方法有：①电泳法。在1％低熔点脂糖凝胶中电泳，切下含DNA的凝胶，回收。②分子筛法。用Sephadeex G50和G200纯化核酸。③选择沉淀法。用亚精胺-HCl在低盐条件下沉淀DNA，回收。④商品纯化柱法。

2．总DNA的纯度判断

土壤中含有大量的腐殖酸，因此在提取的过程中会有腐殖酸污染。腐殖酸可以螯合Mg2＋，或和DNA、蛋白质发生共价结合，从而抑制酶的活性，影响后续的实验操作。由于腐殖酸在230nm处有个吸收峰，通过估算OD260/OD230值可确定所提取的DNA中腐殖酸的污染程度：OD260/OD230值越高，表明DNA纯度越高；反之，腐殖酸污染越严重。由于蛋白质在280nm处有个吸收峰，通过估算OD260/OD280值可确定DNA中蛋白质的污染程度：纯的DNA的OD260/OD280值为1.8；越接近1.8表明DNA越纯；小于1.8表示有蛋白质或酚污染。

3．总DNA直接用于PCR扩增为了验证提取的DNA是否含有杂质，以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，能直接扩增到16S rDNA片段，说明提取的DNA比较纯，可以直接用于后续操作。

【研究目标】

（1）建立一种适合的土壤微生物总DNA的提取方法。

（2）提取的DNA质量达到可直接用于PCR分析的要求。

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