pcr仪器的使用方法（PCR仪操作与维护给你提炼一篇）
pcr仪器的使用方法（PCR仪操作与维护给你提炼一篇）5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度； 1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
今天来给大家整理下PCR实验操作注意事项及常见问题、维护指南。简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。
目前，常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。
实验操作注意事项：
尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意：
1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；
3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；
7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。
如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8.重复实验，验证结果，慎下结论。
PCR主板，控制整个机器运行
来源：网友：70码
具体归类为以下常见的4点，描述如下：
问题一：无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无
原因：
1、模板:含有抑制物，含量低
2、Buffer对样品不合适
3、引物设计不当或者发生降解
4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对策：
1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量
2、更换Buffer或调整浓度
3、重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4、降低退火温度、延长延伸时间
问题二：非特异性扩增
现象：条带与预计的大小不一致或者非 特异性扩增带
原因：
1、引物特异性差
2、模板或引物浓度过高
3、酶量过多
4、Mg2 浓度偏高
5、退火温度偏低
6、循环次数过多
对策：
1、重新设计引物或者使用巢式PCR
2、适当降低模板或引物浓度
3、适当减少酶量
4、降低镁离子浓度
5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法
6、减少循环次数
问题三：拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态
原因：
1、模板不纯
2、Buffer不合适
3、退火温度偏低
4、酶量过多
5、dNTP、Mg 2 浓度偏高
1、纯化模板
2、更换Buffer
3、适当提高退火温度
4、适量用酶
5、适当降低dNTP和镁离子的浓度
6、减少循环次数
问题四：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因：
靶序列或扩增产物的交叉污染
对策：
1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；
2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。
3、各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存
仪器的维护保养
需要注意以下问题：
实验室使用的基因扩增仪，荧光定量PCR仪都是高精度仪器。一旦仪器出现一些温度或者检测上的小偏差，则很可能对实验结果产生较大的影响。因此，学会日常保养和维护是尤为重要的。
1、仪器安置
仪器应安放在湿度较低、灰尘较少并远离水源和热源的地方，无腐蚀性气体或强磁场干扰。
环境温度建议在18~35℃之间。仪器之间应保持50cm 以上距离，降低仪器之间的影响。
2、样品台、热盖定期清洁
用95%乙醇配合棉签、无尘布等工具，清洁样品台。之后运行PCR仪，设定保持温度为50℃，约5~10min，让残余液体挥发去除。
另外，热盖也应该用酒精或纯水定期清洗，确保热盖清洁，温控性能良好。对于荧光定量PCR，清洁样品台和热盖的同时，去除灰尘等杂物，保证光路清洁，降低信号干扰。
3. 使用前预热
老款的PCR仪的性能比不上新款仪器，使用前需要进行预热，不仅对仪器维护有好处，还能节约实验时间。新款的仪器升温快，但还是建议最好能在进行实验前预热2min，这样可以有效延长仪器的使用寿命。
4. 定期运行维护
1.PCR仪器需要定期检测，视制冷方式而定一般半年至少一次。
2.PCR反应的要求温度与实际分布的反应温度是不一致的，当检测发现各孔平均温度差偏离设置温度大于1～2℃时，可以运用温度修正法纠正PCR实际反应温度差。
3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制，要求越短越好，当PCR仪的降温过程超过60s，就应该检查仪器的制冷系统，对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘；对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。
4.一般情况如能采用温度修正法纠正仪器的温度时，不要轻易打开或调整仪器的电子控制部件，必要时要请专业人员修理或利用仪器电子线路详细图纸进行维修。
其他注意事项
另外，由于生产厂家和仪器型号的不同，仪器在保养上也会有差异，有些荧光定量PCR仪，采用底部检测的模式，平时使用仪器附件中的橡胶风球吹去样品台上的灰尘等。必要的时候，可以用棉签沾取无水酒精清洁，但需要注意不要把液体滴入检测孔中，防止影响里面的光路部件。
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